甘草查尔酮A对胶质瘤的增殖抑制及促凋亡作用机制研究

王玖 罗鹏 张磊 郑新瑞 戴舒惠 杨悦凡 饶维 彭程 李娟 马文科 费舟

(第四军医大学西京医院神经外科，陕西 西安 710032)

·脑胶质细胞瘤研究·

甘草查尔酮A对胶质瘤的增殖抑制及促凋亡作用机制研究

王玖 罗鹏 张磊 郑新瑞 戴舒惠 杨悦凡 饶维 彭程 李娟 马文科 费舟*

(第四军医大学西京医院神经外科，陕西 西安 710032)

目的探讨甘草查尔酮A(LCA)对人胶质瘤U87、U251细胞的增殖抑制和促凋亡作用及其机制研究。方法通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖抑制作用，并计算出半数抑制浓度(IC50)，按IC50和100 μM不同浓度进行分组。采用倒置显微镜观察细胞形态，流式细胞术检测细胞凋亡以及Western Blot从蛋白水平检测凋亡相关分子的改变情况。结果MTT显示LCA对人胶质瘤U87、U251细胞具有明显的增殖抑制作用，呈浓度及时间依赖性，LCA对U87、U251细胞48 h的IC50值分别为61.54 μM和53.02 μM，倒置显微镜下观察细胞密度减少，形态发生明显改变。流式细胞术结果显示，LCA可促进胶质瘤U87、U251的细胞凋亡(Plt;0.01)。Western Blot结果显示，LCA干预后可显著降低胶质瘤U87、U251细胞内Bcl-2的表达(Plt;0.01)，相反，增加Bax的表达(Plt;0.05)，呈浓度依赖性。结论LCA对胶质瘤U87、U251细胞具有明显的增殖抑制作用，可能通过内源性凋亡途径诱导其凋亡。

胶质细胞瘤; 甘草查尔酮A; 增殖抑制; 凋亡

胶质瘤是原发性脑肿瘤中的一种常见类型，包括星形细胞瘤，少突胶质细胞瘤和室管膜瘤。根据世界卫生组织(World Health Organization, WHO)标准，胶质瘤分为4个等级，包括毛细胞性星形细胞瘤(I级)，弥散性星形细胞瘤(II级)，间变性星形细胞瘤(III级)以及多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiform, GBM；IV级)[1]。现今，在治疗胶质瘤方面，手术联合放、化疗仍是标准的治疗方案，因为单一手术很难完全切除肿瘤，且复发率高，必须辅以术后放、化疗杀伤残余肿瘤细胞，然而，胶质瘤的化疗依然存在许多局限性。因此，急需革新治疗理念，研发新型药物来有效杀伤胶质瘤细胞，降低复发率及死亡率，提高生活质量以及改善预后等。目前，中草药是研发新药的主要来源，也是现代医学中治疗疾病的首选之一，研究中草药抗肿瘤作用的活性成分以及具有副作用小等优势为治疗肿瘤提供了新思路与新方法[2]。甘草是非常有名的传统中药材(traditional Chinese medicine, TCM)之一，早在公元前2100年就有记载，其含有多达20种三萜类化合物以及将近300种黄酮类化合物等[3]。甘草根部的主要活性提取物-查尔酮，具有多种药理学作用[4]，还有抑制细胞增殖，诱导周期停滞及诱发肿瘤细胞凋亡等特性[5]。甘草查尔酮A(licochalcone A, LCA)是查尔酮的主要活性成分，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗疟疾、抗血管生成、抗肿瘤及抑制肿瘤远处转移等特性[6]。此研究中，我们探讨LCA对人胶质瘤U87、U251细胞的增殖抑制以及阐明其促凋亡的潜在分子机制。

材料与方法

一、主要试剂及抗体

人源性胶质瘤细胞系U87、U251购自于美国标准细胞库(American type culture collection，ATCC)。LCA药粉(分子式：C21H22O4，分子量：338.40)购自于Sigma公司(产品货号为68783)，纯度≥96.0%。用二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide, DMSO)溶解配成100 mmol/L储存液(所含DMSO浓度均lt;1‰，无细胞毒性)，置于-20 ℃冻存。杜伯改良的依格培养基(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM)、双抗(100 IU/mL青霉素、100 μg/mL链霉素)和胰蛋白酶由Gibco公司提供，新生胎牛血清由杭州四季青公司提供。兔源性Bcl-2、兔源性Bax，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗，均购于CST公司。四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl terrazaium, MTT)、流式检测试剂盒为Sigma公司产品。

二、细胞培养

胶质瘤U87、U251细胞常规置于于含有10%胎牛血清及1%双抗的DMEM中， 37℃、5%CO2的孵箱中培养，每1～2 d更换一次培养基。当细胞生长密度达到70%～85%时，用0.25%胰蛋白酶消化，按1 ∶2或1 ∶3比例传代，继续培养。

三、细胞活力

取对数期U87、U251细胞，经0.25%胰酶消化后，通过细胞计数将浓度调整至2×105个/mL接种于96孔板，每孔体积100 μL，过夜贴壁。将LCA加入DMEM中配制不同浓度的药物，使其终浓度为20、40、60、80、100、120 μM，每个浓度设6个复孔，空白对照组没有细胞，对照组为正常细胞但未加LCA处理，其他处理与药物组相同。37 ℃、5%CO2的孵箱培养24或48 h后，每孔加入20 μL 5 g/L MTT，继续培养4 h，弃上清，每孔加入150 μL DMSO，震荡10 min。酶标仪检测490 nm波长处各孔吸光度(optical density, OD)值。按照公式计算抑制率：抑制率=(1-实验组OD/对照组OD)×100%。

四、倒置显微镜观察LCA处理U87、U251细胞后的形态改变

取对数期U87、U251细胞传代培养，贴壁后更换为含有终浓度为IC50及100 μM LCA的DMEM，作用24 h后，在显微镜下观察细胞的变化情况。

五、流式细胞仪检测细胞凋亡

将U87、U251细胞按密度为2×105个/mL接种于6孔板，培养过夜后，换成含有终浓度为IC50及100 μM LCA的DMEM继续培养24 h，消化收集细胞置于离心管中，并用磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered solution, PBS)洗涤。用配置好的1×结合缓冲液(1×binding buffer)洗涤重悬细胞，将密度调整为1×106～5×106个/mL，取100 μL细胞悬液，加入5 μL膜联蛋白-V(Annexin-V)标记的异硫氰酸荧光素(fluoresein isothiocyanate, FITC)反应液后室温避光孵育15～20 min，1×binding buffer 洗涤重悬细胞后再加入5 μL碘化丙啶(propidium iodide, PI)反应液，混匀室温孵育10 min，上机待测。

六、蛋白质免疫印迹检测(Western Blot)

取对数期U87、U251细胞，分别设DMSO对照组和IC50、100 μM浓度组进行药物干预，作用24 h后，小心吸净培养皿中培养液，用4 ℃预冷PBS洗1～2遍，然后加入含有1%蛋白酶抑制剂的裂解液充分裂解细胞，12000 r/min 离心20 min后吸上清提取蛋白。用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)试剂盒以570 nm于酶标仪测定蛋白含量，12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulphate-polyacry lamidegel electrophoresis, SDS-PAGE)分离，上样量为20 μg，再转移至硝酸纤维素膜上，用5%脱脂牛奶室温封闭2 h，用Bcl-2一抗(1 ∶1000)、Bax一抗(1 ∶1000)和β-actin(1 ∶4000)一抗4 ℃孵育过夜。用配置好的含0.1%Tween20的PBS(phosphate-buffered solution tween, PBST)充分洗膜，二抗室温孵育1 h，再用PBST洗膜后发光显色，用Gel-pro软件分析各条带灰度值与相应β-actin的灰度值的比值作统计分析。

七、统计学方法

结 果

一、LCA对U87、U251细胞的增殖抑制

通过MTT实验测定LCA的细胞毒性，数据表明，不同浓度LCA(20、40、60、80、100或120 μM)对U87、U251细胞的增殖抑制作用具有显著的浓度及时间依赖性(图1)。LCA作用后显著抑制两种细胞系的生长，降低生存力。药物处理48 h后，60、100 μM浓度LCA对U87、U251细胞的活性抑制率分别为66.57%和66.31%及94.23%和95.10%，与正常组相比，存在统计学差异(Plt;0.01)。通过SPSS 19.0分析得出LCA对U87、U251细胞48 h的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration, IC50)分别为61.54 μM和53.02 μM。

二、倒置显微镜观察细胞形态

显微镜下观察对照组细胞生长状况良好，轮廓清晰，触角丰满，U87细胞呈梭形，U251细胞呈不规则多角形。IC50和100 μM浓度LCA作用U87、U251细胞24 h后，呈现浓度依赖性的形态改变，细胞皱缩，密度减少，呈圆形贴壁生长，轮廓不规则，边缘圆钝，胞内可见颗粒样物质 (图2)。

三、LCA促进胶质瘤U87、U251细胞凋亡

流式细胞术检测细胞凋亡，结果表明，IC50和100 μM浓度LCA处理U87、U251细胞24 h后，活细胞百分率减少，凋亡细胞百分率明显增加，呈浓度依赖性改变。与对照组相比，100 μM浓度组U87和U251细胞凋亡率分别为25.48%±1.65%和25.63%±0.93%，显著高于对照组的1.87%±0.31%和2.85%±0.25%，差异有统计学意义(Plt;0.01, 图3)。

四、LCA对Bcl-2和Bax蛋白表达的影响

IC50和100 μM浓度LCA处理U87、U251细胞24 h后，Western Blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达变化。结果提示，随着LCA药物浓度的增加，U87和U251细胞Bcl-2蛋白表达量显著降低，相反，Bax蛋白表达量增加。MTT、流式细胞术和Western结果共同提示，LCA可通过促凋亡效应杀伤胶质瘤细胞，调控Bcl-2和Bax蛋白可能是其潜在分子机制 (图4)。

图1 不同浓度LCA作用不同时间对U87、U251细胞的增殖抑制作用(n=3)

Fig 1 Effects of LCA on the inhibition of U87 and U251 cells with different concentrations for 24 h and 48 h (n=3)

A: Effects of LCA on the inhibition of U87 glioma cells with different concentrations for 24 h and 48 h; B: Effects of LCA on the inhibition of U251 glioma cells with different concentrations for 24 h and 48 h

aPlt;0.01,vscontrol group.

图2 不同浓度LCA作用24 h对U87、U251细胞的形态改变(×200)

Fig 2 The effect of LCA on morphology of U87 and U251 cells for 24 h (×200 )

A: U251 control group under inverted microscopy; B: U87 control group under inverted microscopy; C: U251 cells showed typical morphological change after treatment with LCA IC50 for 24 h; D: U87 cells showed typical morphological change after treatment with LCA IC50 for 24 h; E: U251 cells showed typical morphological change after treatment with LCA 100 μM for 24 h (×200); F: U87 cells showed typical morphological change after treatment with LCA 100 μM for 24 h.

图3 LCA诱导胶质瘤U87、U251的细胞凋亡(n=3)

Fig 3 Detection of cellular apoptosis in U87 and U251 cells after treatment with LCA (n=3)

A: Cellular apoptosis in different groups were detected by flow cytometry; B：Quantity of cellular apoptosis detected by flow cytometry

aPlt;0.01,vsU87-Con;bPlt;0.01,vsU251-Con.

图4 LCA对胶质瘤U87、U251细胞Bcl-2和Bax蛋白表达的影响

Fig 4 Effect of LCA on expression of Bcl-2 and Bax in U87 and U251 cells

A: Bcl-2 and Bax were detected by Western Blot after treatment of LCA in U251 cells; B: Quantity of Bcl-2 and Bax detected by Western Blot in U251 cells; C: Bcl-2 and Bax were detected by Western Blot after treatment of LCA in U87 cells; D: Quantity of Bcl-2 and Bax detected by Western Blot in U87 cells

aPlt;0.01,vsBcl-2-Con;bPlt;0.01,vsBax-Con;cPlt;0.05,vsBax-Con.

讨 论

胶质瘤是致死率较高的类型之一，其来源于神经胶质前体细胞，在组织及分子结构中异质性高，占所有原发性脑肿瘤的27%以及占所有原发性恶性脑肿瘤的80%。治疗方面，人工合成化疗药存在许多局限性，比如，经典的系统给药途径很难在CNS以及肿瘤位点达到有效治疗浓度；显著的骨髓抑制等副作用。尽管手术及放、化疗等均有较大改进，但胶质瘤治疗的有效率仍不尽如人意。

目前，中草药为研究热点，因为中草药中含有庞大的天然化学基团，可作用于肿瘤发生、发展的任一阶段；与人工化疗药相比毒副作用小，疗效肯定。甘草是中国传统中药材，其中，LCA是甘草的主要活性提取成分，可通过不同机制杀伤多种肿瘤细胞，例如膀胱癌、胃癌、肝癌等。本研究采用LCA干预胶质瘤U87、U251细胞，探讨LCA是否具有增殖抑制、促凋亡等作用以及研究可能存在的潜在分子机制。

将浓度为100 μM的LCA处理U87、U251细胞48 h后抑制率分别为94.23%和95.10%，呈浓度及时间依赖性，表明LCA对胶质瘤细胞具有明显的增殖抑制作用。Zeng等[7]的研究阐明在人口腔鳞癌SCC-25细胞系中，LCA的IC50值约300 μM，明显高于本实验中的IC50值，说明针对不同肿瘤细胞，LCA的IC50值不同。例如，Xiao等[8]的研究表明在胃癌MKN-28、AGS、MKN-45细胞系中，LCA的IC50值为40 μM；另外，在人膀胱癌T24细胞系中，LCA的IC50值为60 μM[9]。因此，以上结论说明细胞对药物的敏感性决定该药物的IC50值。

通过MTT、细胞形态学及流式细胞术等实验初步证明LCA可显著抑制胶质瘤U87、U251的细胞增殖并促进其凋亡，呈现浓度及时间依赖性。有研究表明，LCA可激活线粒体依赖的内源性细胞凋亡，下调抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的蛋白表达量，显著上调促凋亡蛋白Bax和BAD的蛋白表达量，而且，Bcl-2和Bax在内源性凋亡通路中起重要作用，因为Bcl-2和Bax的平衡决定细胞存活或凋亡[10]。因此本实验通过检测Bcl-2和Bax的表达变化，进一步阐明LCA促凋亡作用的分子机制，Western Blot结果表明，随着LCA药物浓度的增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表达量降低，相反，促凋亡蛋白Bax表达量逐渐增加，说明LCA通过调控Bcl-2和Bax等促使胶质瘤U87、U251细胞凋亡，发挥其抗肿瘤作用。

初步研究证实LCA对U87、U251细胞具有明显的增殖抑制和促凋亡作用，该机制可能与激活线粒体依赖的内源性细胞凋亡通路相关，但针对药物作用靶点以及通路相关机制等还需更深入的研究，为临床应用奠定坚实基础。

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LicochalconeAinhibitsproliferationandinducescellapoptosisinhumanglioblastomacelllines

WANGJiu,LUOPeng,ZHANGLei,ZHENGXinrui,DAIShuhui,YANGYuefan,RAOWei,PENGCheng,LIJuan,MAWenke,FEIZhou

DepartmentofNeurosurgery,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032, China

ObjectiveThe goal of this study is to investigate the cytotoxic effects of licochalcone A on the human glioblastoma cell proliferation and apoptosis and to identify the underlying molecular mechanism.MethodsThe growth-inhibiting effect of licochalcone A(LCA) in the human glioblastoma cells were detected by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay and calculated the half maximal inhibitory concentration (IC50), according to different concentrations grouping IC50 or 100 μM. The cell morphological changes were observed under inverted microscope, the cell apoptosis was examined by the flow cytometry and the protein levels of apoptosis-related molecules were detected by Western Blot.ResultsThe results of MTT revealed that LCA could significantly inhibit U87 and U251 glioma cells proliferation in a dose- and time-dependent manner. The inhibitory concentrations of LCA for U87 and U251 glioma cells at 48 h were 61.54 μm and 53.02 μm, respectively. The density and morphology of the U87 and U251 glioma cells were remarkably changed under inverted microscope. Results of flow cytometry showed that LCA could induce apoptosis in U87 and U251 glioma cells (Plt;0.01). Furthermore, LCA significantly reduced the level of B-cell lymphoma-2(Bcl-2) (Plt;0.01), while increased the levels of Bcl2-Associated X(Bax) (Plt;0.05) in a dose-dependent manner.ConclusionLCA could significantly inhibit the cell proliferation of the human glioblastoma cells, subsequently triggering the mitochondrial apoptotic pathway.

Glioma; Licochalcone A; Inhibiting proliferation; Apoptosis

1671-2897(2017)16-025-05

R 739

A

国家自然科学基金重点项目资助项目(81430043)；“十二五”国家科技支撑计划基金资助项目(2012BAI11B02)

王玖，硕士研究生，E-mail: doctoralixwj@126.com

*通讯作者： 费舟，教授、主任医师，博士生导师，E-mail: feizhou@fmmu.edu.cn

2016-08-20；

2016-10-24)