环靶明在体内及体外可抑制人胶质母细胞瘤A172细胞的生长

薛立新 杨春福

(枝江市人民医院神经外科，湖北 枝江 443200)

·脑胶质细胞瘤研究·

环靶明在体内及体外可抑制人胶质母细胞瘤A172细胞的生长

薛立新*杨春福

(枝江市人民医院神经外科，湖北 枝江 443200)

目的研究Hedgehog信号通路特异性阻断剂环靶明(cyclopamine)在体内及体外对人胶质母细胞瘤A172细胞生长的影响。方法用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测环靶明对A172细胞增殖的抑制作用，流式细胞术检测细胞凋亡率；反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测环靶明处理前后Smoothened蛋白(Smoothened, SMO)、GLI家族锌指蛋白1(GLI-Kruppel family member 1, GLI1)在A172中的mRNA表达及变化，免疫印迹法(Western Blot)检测环靶明处理前后SMO、GLI1在A172中的蛋白表达及变化；环靶明对A172裸鼠皮下移植瘤生长的影响。结果环靶明抑制A172细胞的增殖，其作用呈剂量和时间依赖性；经不同浓度的环靶明作用48 h后A172细胞的凋亡率逐渐升高，明显高于对照组的凋亡率(Plt;0.01)，并存剂量依赖性。SMO、GLI1的mRNA和蛋白均在A172中表达，环靶明下调A172的SMO、GLI1表达。环靶明可抑制A172裸鼠皮下移植瘤的生长。结论在体内及体外阻断Hedgehog信号通路可抑制人胶质母细胞瘤细胞A172的生长。

人胶质母细胞瘤; Hedgehog信号通路; 环靶明; 增殖; 凋亡; 裸鼠

脑胶质瘤是人类最常见的原发性颅内肿瘤，约占成人颅内原发肿瘤的 30%～50%，有很高的发病率和病死率，近年来发病率还有不断增加的趋势。最新资料显示在所有胶质细胞瘤中占半数的胶质母细胞瘤患者1年生存率约为 30%，5年生存率不足5%[1]。目前各种对于脑胶质瘤治疗方式的疗效仍不佳，因此，加强人胶质母细胞瘤基础研究，提高临床诊疗水平，改善患者预后，是“精准”医学时代迫切需要解决的问题。

材料与方法

一、材料和试剂

人胶质母细胞瘤细胞A172 细胞购自美国 ATCC 公司，由本实验室保存。无特定病原体级雌性裸鼠36 只，购自三峡大学实验动物中心。主要试剂包括cyclopamine(环靶明)；tomatidine(番茄碱，环靶明类似药物)购自美国Sigma公司；MTT购自武汉谷歌生物科技有限公司；膜联蛋白V和碘化吡啶双重染色(annexin V and propidium iodide double staining, AnnexinⅤ-FITC/PI)试剂盒购自凯基生物技术公司；β-actin抗体、兔抗人 Gli-1抗体、羊抗人SMO抗体购自美国Santa Cruz公司；反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒和Western Blot试剂盒购自美国Sigma公司；β-actin及SMO、Gli-1基因引物由上海生物工程有限公司合成。

二、MTT法检测环靶明抑制A172细胞的增殖

A172细胞用洛斯维(Roswell Park Memorial Institute, RPMI1640)培养基常规消化传代培养。待培养瓶中传代细胞融合生长至80%左右，以2.0×103个/孔的密度接种96孔板培养24 h，用无血清培养液同步化24 h，实验组分别加入2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L浓度的环靶明，阴性对照组加入相应浓度番茄碱，每种浓度均设5个复孔；空白对照组仅加入等体积培养液，具体操作按说明书进行，实验结果均重复3次。

三、Annexin-V-FITC/PI双染法检测环靶明促进A172细胞凋亡

将A172细胞以1.0×104个/孔的密度接种至6孔板培养过夜，无血清培养液同步化24 h，吸弃培养液，实验组分别加入5.0、10.0、20.0 μmol/L的环靶明，阴性对照组加入番茄碱，每浓度均设3个复孔；空白对照组不加药物。作用48 h后按试剂盒操作说明书进行Annexin-V-FITC/PI双染法，流式细胞仪检测凋亡，实验结果均重复3次。

四、处理后A172细胞 RNA的提取与荧光实时定量PCR检测

在环靶明处理A172细胞48 h后分别收集各组细胞, 用Trizol RNA抽提试剂提取细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。引物序列如下：SMO上游引物序列5'-ATTCATCCAAACCTCTTGAT-3'， SMO下游引物序列，5'-GAGTCATTAACTGGAACATA-3'；GLI1上游引物序列，5'-CTGGTGCACCACATCAACAG-3'，GLI1下游引物序列，5'-CCTTCAAACGTGCACTT GTGT-3'；GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)上游引物序列，5'-TGACATCAAGAAGGTGGTGA-3'，GAPDH下游引物序列，5'-TCATACCAGGAAATGAGCTT-3'。操作按试剂盒操作说明书进行。由熔解曲线和琼脂糖凝胶电泳判断PCR反应的特异性。用基于2-△△Ct方法进行相对定量分析。

五、处理后A172细胞的Western Blot检测

Western Blot从液氮冻存组织或对数生长细胞提取总蛋白，按照本实验室的操作步骤进行实验，使用的一抗分别为兔抗人Gli-1抗体(1 ∶200)、羊抗人SMO抗体(1 ∶200)、β-actin抗体(1 ∶200)。

六、裸鼠移植瘤模型的建立及cyclopamine处理

采用贴壁细胞培养法培养A172细胞，调整细胞悬液浓度为1×108个/mL。裸鼠30只，若裸鼠生长正常即分别于裸鼠左肋背部皮下接种A172细胞悬液0.1 mL/只[2]。注射10 d后，裸鼠随机分成A组(空白组)、B组(PBS磷酸缓冲盐溶液皮下给药组)、C组(cyclopamine皮下给药组)。cyclopamine连续7 d皮下注射剂量为1.2 mg/只[3]。定期观察小鼠精神、饮食及排便情况，称裸鼠重量，测量肿瘤结节的长度(a)、宽度(b)和厚度(c)，按公式V=π(abc)/6计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长体积对比图。实验结束后麻醉动物，手术取下肿瘤组织，称重并分别计算肿瘤平均质量，并绘制肿瘤生长平均质量对比图。

七、统计学分析

应用SPSS 11.0软件统计软件对数据进行处理，采用χ2检验，单因素和多因素方差分析，Plt;0.05时认为差异有统计学意义。

结 果

一、MTT法检测环靶明对A172细胞生长的抑制作用

MTT比色法检测表明环靶明对A172细胞生长有抑制作用(图1A)，且有剂量依赖性，与对照组相比有差异(Plt;0.01)。选取20 μmol/L浓度环靶明作用于培养的细胞，可以发现随着环靶明作用于A172细胞时间的延长，细胞的生长能力明显下降，与对照组相比有非常显著性差异(Plt;0.01，图1B)。

二、环靶明促进A172细胞的凋亡

5、10、20 μmol/L环靶明分别作用于A172细胞48 h后的细胞凋亡率依次为6.19%±0.83%、13.57%±1.30%、23.48%±2.20%，而对照组的凋亡率为1.22%±1.40% (图2)，各组间差异有统计学意义(Plt;0.01)。

图1 环靶明可抑制A172细胞的生长

Fig 1 Cyclopamin inhibited the growth of A172 cells

A: A172 cell inhibition rate (%) of cyclopamine concentrations (aPlt;0.05,bPlt;0.01,vscontrol group); B: 20 μmol/L cyclopamine affects on A172 cell growth curve.

三、环靶明体外处理A172后SMO、GLI1的mRNA表达下调

荧光实时定量PCR检测结果显示各组A172细胞中存在SMO、GLI1的mRNA表达，并且5 μmol/L和10 μmol/L 环靶明实验组SMO、GLI1的mRNA表达较对照组表达下调。PCR扩增产物的琼脂糖凝胶水平电泳检测SMO、GLI1及GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)RT-PCR扩增产物凝胶电泳检测发现有特异的目的条带长度分别约为170、166、177 bp,与SMO、GLI1、GAPDH基因大小的理论值相符(图3)。扩增GAPGH和SMO、GLI1每样本作2复孔，得到两组Ct平均值。5 μmol/L和10 μmol/L环靶明实验组与番茄碱对照组比较，环靶明实验组SMO、GLI1的2-ΔΔCt显著减少(Plt;0.01)，表明SMO、GLI1的mRNA表达下调。

四、环靶明体外处理A172细胞后SMO、GLI1的蛋白表达下调

Western Blot检测结果显示：人胶质母细胞瘤细胞A172存在SMO、GLI1的蛋白高表达。环靶明处理后，SMO、GLI1的蛋白表达有明显下调的趋势(Plt;0.01，图4)。

图2 Annexin-V-FITC /PI双染法检测环靶明促进A172细胞凋亡的结果

Fig 2 Cyclopamine promotes the apoptosis of A172 by Annexin-V-FITC/PI double staining

A: A172 cell apoptosis in the control group; B: A172 cell apoptosis in the 5 μmol/L cyclopamine group; C: A172 cell apoptosis in the 10 μmol/L cyclopamine group; D: A172 cell apoptosis in the 10 μmol/L cyclopamine group

五、皮下cyclopamine给药对A172裸鼠皮下移植瘤的生长影响

裸鼠皮下注射A172细胞悬液10 d后皮下长出平均大小5.7 mm×3.4 mm×3.0 mm肿瘤(图5提示cyclopamine可抑制A172裸鼠皮下移植瘤的生长)。此时实验组裸鼠皮下注射cyclopamine，同时对照组裸鼠皮下注射PBS(磷酸盐缓冲液)。连续7次

cyclopamine给药后实验组出现明显的肿瘤生长抑制，而对照组却继续生长，两组体积对比图(图6A)，组间差异有统计学意义(Plt;0.01)。切除的对照组的肿瘤平均重量(0.79±0.16) g，而对应实验组的肿瘤平均重量(0.25±0.08) g，两组质量对比图(图6B)，组间差异有统计学意义(Plt;0.01)。结果显示cyclopamine能够抑制肿瘤的生长。

图3 SMO、GLI1、GAPDH的琼脂糖凝胶电泳图

Fig 3 Agarose gel electrophoresis of SMO, GLI1 and GAPDH

1: Blank group; 2: Tomatidine control group; 3: 5 μmol/L cyclopamine group; 4: 10 μmol/L cyclopamine group.

图4 环靶明体外处理A172细胞后SMO、GLI1的蛋白表达下调

Fig 4 Cyclopamine-treated A172 cells down-regulated the expression of SMO and GLI1 in vitro

1: Blank group; 2: Tomatidine control group; 3: 5 μmol/L cyclopamine group; 4: 10 μmol/L cyclopamine group.

图5 环靶明可抑制A172裸鼠皮下移植瘤的生长

Fig 5 Cyclopamin inhibited the growth of A172 subcutaneas tumor in nude rat

A: The subcutaneous injection of A172 cell suspension 9 days out of the tumor; B: The subcutaneous injection of A172 cell suspension 9 days out of the tumor; C: The average size of tumor growth was (71.40+3.75) mm3after 4 days of subcutaneous injection of PBS; D: The average size of tumor growth was (47.20±3.90) mm3after 4 days of subcutaneous injection of cyclopamine; E: The average size of tumor growth after subcutaneous injection of PBS and cyclopamine for 7 days; F: The tumor removed after injection of PBS and cyclopamine for 7 days.

图6 环靶明给药后肿瘤生长受抑制的体积及质量对比图

Fig 6 Comparison of volume and mass of tumor growth inhibition after cyclopamine administration

A: The growth of tumor volumes at different times; B: Weight comparison between two groups

aPlt;0.05,bPlt;0.01,vscontrol group.

讨 论

Hh信号通路是一个经典的胚胎发育信号系统，在胚胎发育和胚胎形成后细胞的生长和分化过程中都起着重要作用。Hh信号通路过度激活可引起多种肿瘤细胞的异常增殖，并且在肿瘤细胞增殖与凋亡的调控中起着重要作用。特异性阻断剂环靶明主要通过对抗Hh下游分子SMO而抑制Hh信号通路的活性[4-5]。

本实验首先发现Hh信号通路在A172细胞中呈高激活状态。以往研究证实SMO是该信号通路重要的调节因子，而GLI1是Hh信号通路下游的一个重要因子，起着承上启下的关键性调控作用，SMO和GLI1的高表达是Hh信号通路的过度激活的重要特征[6-7]。通过Western Blot及RT-PCR结果显示SMO、GLI1蛋白及mRNA呈高表达状态；这与S Bensalma等学者研究该通路在脑胶质瘤中的表达情况相一致[8]。进一步研究发现MTT的结果显示2～20.0 μmol/L的环靶明可以剂量依赖性地抑制A172细胞的生长，并且A172细胞的生长抑制作用也随时间的延长而趋于明显；AnnexinⅤ/PI双染法流式细胞术结果提示随着环靶明药物剂量增加,细胞凋亡率逐渐升高。RT-PCR及Western Blot结果显示环靶明作用48 h后， SMO、GLI1的mRNA及蛋白在A172中表达下调，尤以20 μmol/L 环靶明组为著。通过对裸鼠移植瘤的实验发现番茄碱对照组肿瘤呈递增性生长,而同期环靶明实验组生长曲线较为低平，肿瘤生长明显受到抑制。对照组肿瘤质量平均为(0.82±0.11) g，实验组肿瘤质量平均为(0.22±0.06) g，两者差异有显著性。对照组肿瘤平均体积大小为(130.90±5.63) mm3，实验组肿瘤平均体积大小为(36.20±3.59) mm3，两者差异有显著性。

本研究结果表明Hh信号分子对人胶质母细胞瘤细胞A172的增殖起维持作用，在体内及体外阻断该信号通路可以抑制人胶质母细胞瘤细胞A172生长与增殖，并促进细胞凋亡。通过特异性抑制Hh信号传递可以达到分子靶向治疗的目的，而SMO、GLI1蛋白可以作为人胶质母细胞瘤细胞早期诊断和预后判断的分子标志物，因此在人胶质母细胞瘤的防治中可望有良好的应用前景。

1CHEN J, YAKISICH J S. Emerging concepts and therapeutics strategies for the treatment of brain tumors [J]. Anticancer Agent Med Chem, 2014, 14(8): 1063-1064.

2XUE J, ZHOU A, TAN C, et al. Forkhead box M1 is essentialfor nuclear localization of glioma-associated oncogene homolog 1 in glioblastoma multiforme cells by promoting importin-7 expression [J]. J Biol Chem, 2015, 290(30): 18662-18670.

3THAYER S P, DI MAGLIANO M P, HEISER P W, et al. Hedgehog is an earlyand late mediator of pancreatic cancer tumorigenesis [J]. Nature, 2003, 425(6960): 851-856.

4WESTPHAL M, HILT D C, BORTEY E, et al. A phase 3 trial of local chemotherapy with biodegradable carmustine wafers in patients with primary malignant glioma [J]. Neuro Oncol, 2003, 5(2): 79-88.

5CUI D, CHEN X, YIN J, et al. Aberrant activation of Hedgehog/gli1 pathway on angiogenesis in gliomas [J]. Neurology (India), 2012, 60(6): 589-596.

6BENSALMA S, CHADENEAU C, LEGIGAN T, et al. Evaluation of cytotoxic properties of a cyclopamine glucuronide prodrug in rat glioblastoma cells and tumors [J]. J Mol Neurosci, 2015, 55(1): 51-61.

7BRAUN S, OPPERMANN H, MUELLER A, et al. Hedgehog signaling in glioblastoma multiforme [J]. Cancer Biol Ther, 2012, 13(7): 487-495.

8BENSALMA S, CHADENEAU C, RENOUX B, et al. 199 Cytotoxic activity of a cyclopamine glucuronide prodrug against glioblastoma cells [J]. Eur J Cancer, 2012, 48(Suppl 5): S49.

CyclopamineinhibitsthegrowthofhumanglioblastomaA172cellsinvivoandinvitro

XUELixin,YANGChunfu

DepartmentofNeurosurgery,ZhijiangHospital,Zhijiang443200, China

ObjectiveThe study aims to investigate Hedgehog signaling pathway specific blocker (cyclopamine) effects human glioblastoma A172 cells growth in vivo and in vitro.MethodsThe proliferation of A172 cells was detected with Methylcyclopentadienyl Manganese Tricarbonyl (MTT) method. Cells apoptotic rate was analyzed with the flow cytometry assay. The expressions of the tumor-related genes and proteins in A172 cells before and after cyclopamine treatment was detected with reverse transcriotion-polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western Blot. Cyclopamine affected A172 tumor growth in nude mice.ResultsCyclopamine inhibited the growth of A172 cells in a time- and dose-dependent manner. After cyclopamine treatment with different concentrations for 48 h, the apoptotic rates of A172 cells were increased in a dose-dependent manner, which were significantly higher than those of the control group (Plt;0.01). Furthermore, cyclopamine down-regulated the mRNA and protein levels of SMO and GLI1 in A172 cells. Cyclopamine inhibited A172 tumor growth in nude mice.ConclusionBlocking hedgehog signaling pathway inhibits human glioblastoma A172 cells growth in vivo and in vitro.

Human glioblastoma; Hedgehog signaling pathway; Cyclopamine; Proliferation; Apoptosis;Nude mice

1671-2897(2017)16-020-05

R 739

A

薛立新，硕士研究生，E-mail:1023823062@qq.com

*通讯作者： 薛立新，硕士研究生，E-mail:1023823062@qq.com

2016-01-25；

2016-06-20)