抑制Survivin可抑制贝伐珠单抗导致的胶质瘤细胞侵袭性增强

王鹏 张剑宁 陈金辉 于新 刘锐 孙艳杰

(海军总医院神经外科，北京 100048)

·脑胶质细胞瘤研究·

抑制Survivin可抑制贝伐珠单抗导致的胶质瘤细胞侵袭性增强

王鹏 张剑宁*陈金辉 于新 刘锐 孙艳杰

(海军总医院神经外科，北京 100048)

目的探讨Survivin对人脑胶质瘤细胞经贝伐珠单抗治疗后侵袭性的影响。方法构建抑制Survivin表达的U251/sur(-)胶质瘤细胞，经贝伐珠单抗处理。采用四甲基偶氮唑蓝法检测细胞增殖，划痕试验检测细胞的迁移能力，Transwell试验检测细胞的侵袭能力。结果经贝伐珠单抗处理后，U251细胞的迁移、侵袭能力明显增强。与亲代U251细胞相比，抑制Survivin的U251/sur(-)细胞经贝伐珠单抗处理后，其迁移和侵袭能力明显降低。与单独抑制Survivin或单独使用贝伐珠单抗相比，将二者合用后胶质瘤细胞的增殖能力明显下降。结论抑制Survivin可明显抑制贝伐珠单抗处理后胶质瘤细胞侵袭性增强，并与贝伐珠单抗产生协同效应，抑制胶质瘤细胞增殖。

胶质瘤; 贝伐珠单抗; 存活蛋白; 侵袭

胶质母细胞瘤(glioblastoma, GBM)是颅内最常见且侵袭性极强的恶性肿瘤，虽然基础和临床研究不断进展，新型治疗方法不断出现，例如多种分子靶向药物被研发，并相继进入临床试验及临床，但其预后仍不乐观，确诊后患者的中位生存时间为12～14个月[1]。

胶质母细胞瘤的典型特征为瘤组织内富含血管，以往研究表明胶质母细胞瘤可分泌较高水平的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)，并且临床试验发现针对肿瘤血管形成的人源化VEGF靶向单克隆抗体贝伐珠单抗，对复发胶质瘤具有较好的治疗效果[2]；新近2项贝伐珠单抗联合放疗及替莫唑胺治疗新发胶质母细胞瘤患者的前瞻性III期临床试验(AVAglio amp; RTOG 0825)表明：贝伐珠单抗联合放疗及替莫唑胺化疗，可以延长新诊断胶质瘤患者的无症状生存时间(progression-free survival, PFS)，但是患者的总生存时间(overall survival, OS)没有增加[3]。抗VEGF治疗(包括贝伐珠单抗在内)可以迅速减少肿瘤血管的通透性，在磁共振影像上表现为肿瘤强化体积的减少，但是患者最终的预后并没有改变，原因可能与抗VEGF治疗增强瘤细胞的侵袭性有关[4]。

Survivin属于凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein, IAP)家族成员，在肿瘤的发生发展中发挥重要作用，不仅可以影响细胞分裂及细胞增殖，还在肿瘤细胞的迁移及侵袭中发挥作用。

因此本实验拟首先明确贝伐珠单抗治疗是否可以导致胶质瘤细胞侵袭性增强，进而下调胶质瘤细胞中Survivin的表达，观察其是否可以抑制贝伐珠单抗治疗导致的胶质瘤细胞侵袭性，并探讨抑制Survivin是否可以提高贝伐珠单抗的治疗效果。

材料与方法

一、材料

U251胶质瘤细胞，Survivin的干扰质粒由第四军医大学西京脑科医院章翔教授惠赠。改良Eagle培养基(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM)购自Hyclone公司，胎牛血清购自Gibco公司，贝伐珠单抗购自罗氏制药有限公司，Matrigel购自BD公司，四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)购自Sigma公司，Transell小室购自Millipore公司，龙胆紫购自Sigam公司。

二、方法

1.细胞培养：人胶质母细胞瘤系U251细胞用含10 mL/L胎牛血清的DMEM培养基，在37 ℃、50 mL/L CO2的孵箱中培养。将U251细胞分别转染pRNAT(空载体)、pRNAT-Survivin shRNA[针对Survivin基因的短发卡RNA(short hairpin RNA，shRNA)真核表达载体)、pRNAT-NS si [无关序列(nonsense sequence, NS)载体]，采用G418筛选，构建的稳定转染细胞系为：U251/pCtrl细胞、U251/sur(-)细胞和U251/NS si细胞。

2.MTT法检测细胞增殖情况：将U251、U251/sur(-)、U251/pCtrl、U251/NS si细胞接种至24孔板，每孔1×104个细胞，每组细胞接种9孔。1 d后(细胞贴壁)分别加入不同浓度的贝伐珠单抗。在接种的第2、4、6天，每组细胞各取3孔计数，以MTT法测定各组的吸光度值，绘制细胞生长曲线。

3.划痕实验检测细胞迁移能力：分别以1×105细胞/孔的密度，将各组细胞接种于6孔板中，生长至90%的融合度后，用20 μL枪头垂直于六孔板底部划痕，无血清的DMEM培养液洗去除划下的细胞，加入含指定浓度贝伐珠单抗的无血清培养基后用倒置相差显微镜记录此时及24 h后细胞的迁移情况。

4.Transwell实验检测细胞侵袭能力：基质胶包被的Transwell小室放入 24 孔培养板中，无血清培养液加至下室，分别以 5×104细胞/孔的密度，将U251、U251/sur(-)、U251/pCtrl、U251/NS si细胞接种至上室，孔径为 8 μm的滤膜将上室的细胞和下室的培养液隔开，在上室和下室中加入指定浓度的贝伐珠单抗。在37 ℃孵箱中培养 24 h后，将位于滤膜上层的细胞擦除，穿过滤膜，位于滤膜下部的细胞用龙胆紫染色后，倒置显微镜观察。

2.从格兰杰因果关系看，广西对东盟出口贸易与跨境人民币结算两者间互为格兰杰原因关系，而广西对东盟进口贸易与跨境人民币结算两者间不存在格兰杰原因关系。

结 果

一、不同浓度贝伐珠单抗对细胞增殖能力的影响

为了排除贝伐珠单抗对细胞增殖能力的影响，进而因细胞增殖能力差异导致贝伐珠单抗处理后细胞侵袭及迁移能力的差异，首先绘制不同浓度的(0、2、4、6、8和10 mg/mL)贝伐珠单抗处理后，U251细胞的生长曲线。以浓度为0、2、4、6 mg/mL的贝伐珠单抗处理U251细胞，细胞的增殖能力无明显差异(Pgt;0.05，图1 )；以浓度为8、10 mg/mL的贝伐珠单抗处理U251细胞，细胞的增殖能力明显下降(Plt;0.01，图1 )。因此下述试验选用的贝伐珠单抗的浓度均为6 mg/mL。

二、贝伐珠单抗可增强胶质瘤细胞的迁移能力

将未经贝伐珠单抗处理U251细胞(对照组细胞, Ctrl)的迁移距离设为100%，其他各组细胞迁移的距离与对照组进行比较后，表示成百分率的形式。划痕实验提示，与未经贝伐珠单抗处理的U251细胞相比，经贝伐珠单抗处理的U251细胞，迁移能力明显增强(Plt;0.01，图2、3)。

三、贝伐珠单抗可增强胶质瘤细胞的侵袭能力

四、抑制Survivin可降低贝伐珠单抗处理后细胞迁移能力的增强

抑制Survivin的U251细胞(U251/sur(-))，与亲代U251(Ctrl)细胞相比，迁移能力减弱(Plt;0.01，图2、3)；经贝伐珠单抗处理后，抑制Survivin的U251细胞(U251/sur(-))，与亲代U251(Ctrl)细胞相比，迁移能力减弱(Plt;0.01，图2、3) 。

五、抑制Survivin可降低贝伐珠单抗处理后细胞侵袭能力的增强

抑制Survivin的U251细胞(U251/sur(-))，与亲代U251(Ctrl)细胞相比，侵袭能力明显减弱(Plt;0.01，图4、5)；经贝伐珠单抗处理后，抑制Survivin的U251细胞(U251/sur(-))，与亲代U251(Ctrl)细胞相比，侵袭能力明显减弱(Plt;0.01，图4、5)。

六、抑制Survivin可与贝伐珠单抗发挥协同效应，抑制胶质瘤细胞增殖

以浓度为6 mg/mL的贝伐珠单抗处理U251细胞，细胞的增殖能力未见下降(Pgt;0.05, 图1)；将贝伐珠单抗(6 mg/mL)与抑制survivin联合应用，与单独使用贝伐珠单抗或单纯抑制survivin相比，U251细胞增殖能力明显下降(Plt;0.01, 图6)。

图1 各组细胞生长曲线

Fig 1 Growth curve of U251 cells in different groups

aPlt;0.01,vs0 mg/mL.

图2 贝伐珠单抗和Survivin对U251细胞迁移能力的影响 (×100)

Fig 2 Effect of bevacizumab (Bev) or Survivin on U251 cells migration detected by scratch assay (×100)

A: The wound of U251 cells without the treatment of Bev at baseline; B: The wound of U251 cells without the treatment of Bev at 24 h later; C: The wound of U251 cells treated by Bev at baseline; D: The wound of U251 cells treated by Bev at 24 h later; E: The wound of U251/sur(-) cells without the treatment of Bev at baseline; F: The wound of U251/sur(-) cells without the treatment of Bev at 24 h later; G: The wound of U251/sur(-) cells treated by Bev at baseline; F: The wound of U251/sur(-) cells treated by Bev at 24 h later.

图3 定量分析贝伐珠单抗和Survivin对U251细胞迁移能力的影响

Fig 3 Quantitative analysis of bevacizumab (Bev) or Survivin on U251 cells migration in vitro

aPlt;0.01,vsCtrl;bPlt;0.01,vsBev.

图4 贝伐珠单抗和Survivin对U251细胞侵袭能力的影响(×100)

Fig 4 Effect of bevacizumab (Bev) or Survivin on U251 cells invasion in vitro (×100)

A: The U251 cells that had migrated across transwell filters without the treatment of Bev; B: The U251 cells that had migrated across transwell filters treated by Bev; C: The U251/sur (-) cells that had migrated across transwell filters without the treatment of Bev; D: The U251/sur(-) cells that had migrated across transwell filters treated by Bev.

图5 贝伐珠单抗和Survivin对U251细胞侵袭能力的影响

Fig 5 Quantiative analysis of bevacizumab (Bev) or Survivin on U251 cells invasion in vitro

aPlt;0.01,vsCtrl;bPlt;0.01,vsBev.

图6 各组细胞生长曲线

Fig 6 Growth curve of U251 cells in different groups

aPlt;0.01,vsBev (+).

讨 论

抗血管形成治疗是一种新型的胶质瘤治疗方法，人源化针对VEGF的单克隆抗体贝伐珠单抗，对复发的胶质母细胞瘤具有显著的治疗价值；但是抗血管治疗后，肿瘤细胞具有更强的侵袭性，很多患者表现出弥漫性或多中心的进展，并导致病情迅速恶化[5-6]。因此贝伐珠单抗虽然可以使患者在短时间内受益，但是亟需进一步研究明确抗血管形成治疗如何影响肿瘤细胞的生物学特性，阐明其中的机制，以克服抗血管形成治疗导致的肿瘤细胞侵袭性增强，提高胶质瘤患者的存活时间。

我们的研究发现贝伐珠单抗可直接作用于U251细胞，使其侵袭及迁移能力增强，这就提示我们靶向性抑制VEGF或者说干扰肿瘤细胞的VEGF-VEGF受体信号转导通路，可以使肿瘤细胞的表型发生改变，对治疗产生抗性。但是也有研究认为，应用贝伐珠单抗后，使肿瘤组织内的血供减少，加剧了肿瘤组织内的缺氧微环境，通过缺氧诱导肿瘤基因表达的改变，进而使肿瘤细胞的侵袭性增强[7]。存在上述不同解释，说明肿瘤细胞侵袭能力改变的机制非常复杂，究竟何种机制在其中发挥主要作用，二者有无关联，有待进一步的研究阐明。

大量研究表明，Survivin在肿瘤细胞中发挥重要作用，包括抑制凋亡，促进分裂，增加肿瘤细胞耐药性，维持肿瘤干细胞，促进肿瘤细胞侵袭及转移等；回顾性研究分析及荟萃分析提示Survivin与乳腺癌、直结肠癌、胃癌、甲状腺癌、食管癌、非小细胞肺癌的转移及侵袭性密切相关[8]。IAP家族可以通过Ras相关的C3肉毒素底物1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1, Rac1)的泛素化调控受体辅助因子(receptor accessory factor, RAF)，发挥调节肿瘤细胞迁移的作用；也有研究提示IAPs可以通过进化的保守性促进肿瘤细胞迁移[9]；作为IAP家族的成员，越来越多的研究提示Survivin是重要的肿瘤细胞迁移及侵袭的调节因子，在肿瘤的迁移中发挥重要作用。Survivin调控细胞迁移的信号转导通路可能与其抑制凋亡及促进分裂的信号通路不同；有研究指出Survivin可通过上调基质金属蛋白酶，消化细胞外基质，发挥促进细胞迁移的作用[10]。

我们的研究首次发现靶向抑制肿瘤组织中的Survivin可以明显抑制贝伐珠单抗导致的肿瘤细胞侵袭性增强。以往的研究提示，Survivin在细胞分裂及细胞增殖中发挥重要作用，因此抑制肿瘤细胞的Survivin，是通过抑制肿瘤细胞增殖，导致肿瘤细胞数量减少，进而间接起到了抑制贝伐珠单抗导致的侵袭性增强的作用，还是通过调控细胞迁移及侵袭的信号转导通路，直接发挥了抑制贝伐珠单抗导致的肿瘤细胞侵袭性增强的作用，或者两者皆而有之，有待进一步研究阐明。更有意思的现象是，将二者联合应用，与单纯抑制肿瘤细胞中的Survivin或单独使用贝伐珠单抗相比，肿瘤细胞的增殖能力明显下降，提示二者联合应用可产生协同效应，但是通过何种机制发挥的协同效应，也需要进一步研究明确。

总之，靶向抑制肿瘤组织中的Survivin与贝伐珠单抗联合应用，可能会对胶质瘤的治疗起到积极的促进作用，有望提高胶质瘤患者的治疗效果。

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3GILBERT M R, DIGNAM J J, ARMSTRONG T S, et al. A randomized trial of bevacizumab for newly diagnosed glioblastoma [J]. N Engl J Med, 2014, 370(8): 699-708.

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KnockdownofSurvivinexpressioninhibitsgliomacellsinvasioninducedbybevacizumabtreatmentingliomacells

WANGPeng,ZHANGJianning,CHENJinhui,YUXin,LIURui,SUNYanjie

DepartmentofNeurosurgery,NavyGeneralHospital,Beijing100048, China

ObjectiveThe study aims to investigate the effect of Survivin on glioma cells invasion after treated by bevacizumab.MethodsSurvivin shRNA plasmids were transfected in to U251 cells. The cells proliferation, migration, and invasion were determined by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay, wound healing, and transwell assay, respectively.ResultsThe migration and invasion of U251 cells were increased by bevacizumab. Knockdown of Survivin by RNAi inhibited bevacizumab-induced cell invasion. Furthermore, the combined administration of bevacizumab and knockdown of Survivin significantly suppressed the proliferation of glioma cells compared to bevacizumab treatment or knockdown of Survivin alone.ConclusionDown-regulation of Survivin could inhibit glioma cells invasion induced by bevacizumab treatment, therefore Survivin might be a potential target to ameliorate the therapeutic efficiency of bevacizumab.

Glioma; Bevacizumab; Survivin; Invasion

1671-2897(2017)16-011-04

R 739.41

A

王鹏，博士，E-mail: 986257010@qq.com

*通讯作者： 张剑宁，教授、主任医师，博士生导师，E-mail: jnzhang2005@163.com

2016-05-08；

2016-10-30)