12例慢性化脓性中耳炎分离西弗射盾子囊霉的鉴定特征分析*

马晓波，徐和平，房丽丽，时艺，朱波，郑燕青

(厦门大学附属第一医院检验科，福建厦门 361003)

·调查研究·

12例慢性化脓性中耳炎分离西弗射盾子囊霉的鉴定特征分析*

马晓波，徐和平，房丽丽，时艺，朱波，郑燕青

(厦门大学附属第一医院检验科，福建厦门 361003)

目的分析自慢性化脓性中耳炎患者中耳分泌物分离的西弗射盾子囊霉的实验室检查特征，为少见真菌的诊治提供依据。方法纳入西弗射盾子囊霉相关慢性化脓性中耳炎患者12例。培养其中耳分泌物，观察真菌的菌落特征和镜下特征，采用Vitek 2 Compact全自动微生物分析系统进行菌种鉴定。结果西弗射盾子囊霉在血平板、巧克力平板和沙氏平板等临床常用培养基上均可生长，且在28 ℃和35 ℃均生长较好。培养1周后菌落呈奶油色、镶嵌生长，质地硬，周边呈花边样。该菌在科玛嘉念珠菌显色培养基上为中央蓝色、边缘白色的凸起小菌落。镜下特征为孢子和菌丝同时可见，小培养观察时可见菌丝有分隔，真菌孢子呈芽生型、形态卵圆、部分可沿菌丝排列。西弗射盾子囊霉可同化利用许多碳水化合物和常见氨基酸。用Vitek 2 Compact全自动微生物分析系统可鉴定该菌。结论西弗射盾子囊霉是一种非常少见的机会致病性真菌，临床实验室应重视中耳分泌物中此真菌的培养鉴定。

西弗射盾子囊霉；慢性化脓性中耳炎；形态学检查；鉴定

西弗射盾子囊霉(Stephanoascusciferrii)既往曾用名有西弗念珠菌(Candidaciferrii)、类西弗念珠菌(Candidaallociferrii)和西弗毛滴虫(Trichomonascusciferrii)，是一种非常少见的机会致病性真菌。目前，已有报道显示西弗射盾子囊霉可导致多种感染[1-7]。2012年6月至2017年6月期间我院共诊治慢性化脓性中耳炎患者938例，其中，12例患者中耳分泌物培养分离到西弗射盾子囊霉。本文总结分析12例西弗射盾子囊霉的培养鉴定要点及慢性化脓性中耳炎患者的临床特征，以期为少见真菌的诊治提供实验依据及临床经验，报道如下。

1 材料与方法

1.1研究对象 收集12例慢性化脓性中耳炎患者的中耳分泌物，标本的采集和送检遵循《全国临床检验操作规程》(第3版)[8]。男性4例、女性8例，年龄(43.3±21.9)岁，职业包括公司职员、学生、公务员和无业人员等。

1.2试剂与仪器 哥伦比亚血平板、沙氏平板和巧克力平板(郑州安图生物公司)；科玛嘉显色平板(上海科玛嘉公司)。Vitek 2 Compact全自动微生物分析系统及配套的YST鉴定卡、ATB FUNGUS 3试条(法国生物梅里埃公司)。

1.3细菌培养及鉴定 标本接种哥伦比亚血平板、巧克力平板、沙氏平板以及科玛嘉显色平板，分别置于35 ℃及28 ℃培养，24 h后连续观察菌落形态。真菌小培养操作参照《医学真菌学》[9]。经革兰染色、乳酸酚棉蓝染色后观察菌体形态及小培养的菌丝形态。用Vitek 2 Compact全自动微生物分析系统及配套的YST鉴定卡进行细菌鉴定。

1.4分子生物学鉴定 用德国Qiagen试剂盒提取真菌DNA，采用ITS通用引物(ITS-1： 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS-4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)进行PCR扩增，产物送北京睿博兴科公司测序，结果经https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed网站BALST比对。

1.5药敏试验 用ATB FUNGUS 3试条进行体外抗菌活性检测，35 ℃温育24 h观察结果。

2 结果

2.1菌落特征 西弗射盾子囊霉在哥伦比亚血平板、巧克力平板、沙氏平板均能生长，且在28 ℃和35 ℃均生长良好。培养24 h后可见圆形光滑小菌落，呈乳白色；48 h菌落呈镶嵌生长，质地硬，不易刮起、研碎;1周后可见奶油色(或略呈淡黄色)、粗糙大菌落，表面可见细微绒毛状气生菌丝，凸出平板生长，菌落中心呈脑回样或菜花状、菌落边缘皱折似花边。西弗射盾子囊霉在科玛嘉显色培养基上生长良好，菌落镶嵌平板，呈规则圆形，菌落中心蓝色、边缘白色，形似“小蘑菇”状。见图1。随培养时间延长，菌落开始粗糙，有脑回状沟槽，边缘不整。

注：A, 血平板35 ℃培养10 d；B, 沙氏平板28 ℃培养1周；C, 科玛嘉显色平板35 ℃培养5 d。

图1 西弗射盾子囊霉的菌落形态

2.2镜下特征 真菌菌落直接革兰染色镜检见革兰阳性酵母样真菌及细长菌丝，孢子为单细胞、卵圆形、沿菌丝周边分布，见图2。采用小培养法观察，可见丰富的菌丝体，分枝分隔。分枝菌丝上，芽生出子囊孢子，孢子为单细胞、卵圆形状，排列紧密、大小不一，另外部分孢子沿菌丝排列生长，见图2。

注：A,血平板35 ℃培养10 d后革兰染色，见酵母样真菌及细长菌丝；B,小培养28 ℃培养1周后乳酸酚棉蓝染色见分枝分隔菌丝；C,小培养28 ℃培养1周后乳酸酚棉蓝染色见子囊孢子。

图2 西弗射盾子囊霉的镜下形态(×1 000)

2.3生化反应特征 Vitek 2 Compact全自动微生物分析系统及配套YST鉴定卡可信度为99%，重复鉴定率为100%，生化反应可同化利用大多数碳水化合物，包括半乳糖、木糖、蔗糖、D-葡萄糖、D-麦芽糖、D-山梨糖、D-海藻糖、D-棉子糖、D-甘露糖、L-阿拉伯糖。并可同化利用乳酸盐、醋酸盐、葡萄糖酸盐、L-苹果酸、丙三醇、木糖醇、D-山梨醇、亮氨酸、精氨酸、酪氨酸等。

2.4分子生物学特征 经ITS测序，结果经BALST比对，与基因库注册的Trichomonascusciferrii(序列号：KP132796)和Candidaallociferrii(序列号：KY101922)同源性均为99%。

2.5体外药敏特征 所有菌株体外最低抑菌浓度(MIC)均为：5-氟胞嘧啶≤4 μg/mL、两性霉素B≤0.125 μg/mL、氟康唑≤1 μg/mL、伊曲康唑≤0.125 μg/mL、伏立康唑≤0.06 μg/mL。

3 讨论

子囊菌隶属于真菌界(Fungi)、子囊菌门(Ascomycota)、酵母纲(Saccharomycetes)、酵母目(Saccharomycetales)、酵母菌科(saccharomycetales)、子囊菌属(Stephanoascus)[10]。子囊菌有很多种，共同特征是有性生殖形成子囊孢子[11]。西弗射盾子囊霉是临床上子囊菌病病原体中最主要的一个种。

据调查，西弗射盾子囊霉在耳道分泌物、脑脊液、腹膜透析液和血液中均有分离的报道[1-7]。2012年6月至2017年6月期间我院共诊治慢性化脓性中耳炎患者938例，但仅不到1/4的患者送检标本进行培养检查，分离菌包括金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、卡他莫拉菌、β溶血链球菌以及曲霉和念珠菌等。西弗射盾子囊霉为临床少见真菌，我们在12例慢性化脓性中耳乳突炎的中耳分泌物分离到该菌。患者的临床病程长短不一，不仅累及老年患者，而且可在中青年患者发病，免疫力正常人群亦可发病。临床上，西弗射盾子囊霉相关慢性化脓性中耳炎表现为耳道流脓，脓液呈黄色略带臭味，多伴耳鸣，常会导致鼓膜穿孔引起听力下降，因此会影响患者的生活质量。炎症发生部位多为乳突，治疗上外科手术能得到比较理想的效果。

临床采集中耳脓液进行培养，对发现西弗射盾子囊霉有较高价值。而该菌在标本直接涂片上形态无特异性、与酵母菌相似，不利于早期诊断。西弗射盾子囊霉在血平板、巧克力平板和沙氏平板等临床常用培养基上均可生长，且在28 ℃和35 ℃均生长较好。值得注意的是，该菌在科玛嘉念珠菌显色培养基上为中心蓝色、边缘白色的脑回状菌落，易于观察。西弗射盾子囊霉的镜下特征为孢子和菌丝同时可见，小培养观察时可见菌丝有分隔，真菌孢子呈芽生型、形态卵圆、部分可沿菌丝排列。西弗射盾子囊霉可同化利用大多数碳水化合物和氨基酸等，这可与毛孢子菌区别，毛孢子菌缺乏利用碳水化合物的能力，镜下可见关节样孢子。

我们采用ATB Fungus 3 酵母菌药敏测试条检测抗真菌药物对西弗射盾子囊霉的体外活性，显示5-氟胞嘧啶的MIC为≤4 μg/mL、两性霉素B≤0.125 μg/mL、氟康唑≤1 μg/mL、伊曲康唑≤0.125 μg/mL、伏立康唑≤0.06 μg/mL，与文献报道[1]相同。由于ATB Fungus 3用于念珠菌和隐球菌药敏测试，用于西弗射盾子囊霉还有待进一步研究。 综上，西弗射盾子囊霉是一种非常少见的机会致病性真菌，会导致慢性化脓性中耳乳突炎。西弗射盾子囊霉不难培养，临床实验室应加强对该菌的认识。

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2017-07-30)

(本文编辑：刘群)

IdentificationandfeatureanalysisofStephanoascusciferriiisolatedfrom12caseswithchronicsuppurativeotitismedia

MAXiao-bo,XUHe-ping,FANGLi-li,SHIYi，ZHUBo,ZHENGYan-qing

(DepartmentofClinicalLaboratoryMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofXiamenUniversity,Xiamen361003,Fujian,China)

ObjectiveTo study the laboratory features ofStephanoascusciferriiisolated from middle ear excretion of the patients with chronic suppurative otitis media for providing the basis of diagnosis for the rare fungus infection.MethodsThe study was performed for 12 patients who were suffered from chronic suppurative otitis media associated withStephanoascusciferrii. The secretions of middle ear were cultured and the macroscopic features of colony and cells of the fungi were observed. The species of the fungi was identified by Vitek 2 Compact system.ResultsStephanoascusciferriimay grow on common media such as blood plate, chocolate plate and sabourauad plate, at 28 to 35 ℃. The form of the colonies displayed cream-colored, rough, hard and wrinkled quality after 1 week incubation. On CHROMagar medium the colonies looked like small mushroom with blue center and white edge. Under microscopy, abundant branched septate mycelium with small ramified chains of oval blastoconidia and the conidia were arranged along the side of hyphae. The fungi strain may assimilate lots of carbohydrates and common amino acid. Vitek 2 Compact automated system should be able to identifyStephanoascusciferrii.ConclusionStephanoascusciferriiis a rare opportunistic pathogenic fungus. In clinical laboratories special attentions should be paid to culture and identification of the fungus from middle ear excretion.

Stephanoascusciferrii; chronic suppurative otitis media; morphological examination; identification

10.13602/j.cnki.jcls.2017.10.11

福建省卫生联合资金面上项目(2016J01647)。

马晓波，1980年生，男，副主任技师，硕士研究生，主要从事病原检验及细菌耐药研究。

郑燕青，副主任技师，大学本科，E-mail:zheng_yan_qing@126.com。

R446.5

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