微生物图片拍摄技术的应用探讨

陈东科，孙长贵

(1.北京医院检验科，北京 100730；2.中国人民解放军第一一七医院检验科，杭州 310013)

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微生物图片拍摄技术的应用探讨

陈东科1，孙长贵2

(1.北京医院检验科，北京 100730；2.中国人民解放军第一一七医院检验科，杭州 310013)

微生物形态学图片在微生物鉴定、临床涂片报告(图文报告)、鉴定仪器的专家系统、室间质量评价、教学及学术交流、资料保存等方面十分重要，因此，拍摄微生物图片是临床微生物检验人员需要掌握的技能之一。该文介绍了拍摄微生物图片需要运用到的摄影知识，拍摄前对制片、染色和培养的要求，手工或辅助拍摄装置，探讨拍摄不染色和染色标本镜下形态、感染部位、菌落形态、药物敏感性试验的图片时对构图、背景、光线、比例尺等的运用技巧和注意事项，指出拍摄图片的清晰度与拍摄器材的像素、拍摄稳定性、光线等有直接关系，镜下图片的拍摄效果用辅助拍摄装置的比手持拍摄效果好，菌落拍摄除设备外还与拍摄技巧有关。

微生物；形态学；图片；摄影技术

形态学检验对微生物鉴定具有导航的作用，正确的形态学检验结果是准确鉴定细菌的坚实基础[1]。作为基本功的形态学知识，是每一位微生物检验技术人员必须掌握的技能。在实际工作中微生物形态学图片的用途非常广泛，如临床涂片报告(图文报告)[2]、鉴定仪器的专家系统、室间质量评价[3]、教学、资料保存、发表论文、编辑图谱[4]等都需要清晰的图片。因此，学会拍摄微生物图片也成为临床微生物检验人员需要掌握的技能之一。本文介绍微生物镜下及菌落形态的拍摄技巧，探讨临床微生物检验图片拍摄有关的技术、辅助设备及拍摄技巧，以期指导微生物检验工作者拍出满意的图片，可以满足各方面的应用需求。

1 拍摄前的准备工作

1.1涂片 要拍出病原体在标本中的生存状态、形态特征及染色特性，制片十分重要。无论是不染色片和染色片，制片的基本原则是尽可能保持标本的结构不被破坏，单层细胞厚度。片子染色后整片着色均匀一致、细胞核与细胞浆清晰、菌体是被吞噬或是黏附可辨，这是图片拍摄对涂片的基本要求。

1.2染色 按照染色操作要求进行，并以质控片达标在控为准。自动染片机的使用应根据制片的厚薄采用不同的程序进行染色，同时用质控片进行质控。革兰染色质控片制备：挑取经过夜培养的金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌(推荐用ATCC标准菌株)，各配制成2麦氏浊度单位浓度的菌液，两菌液混匀后挑取一接种环涂成直径1.5 cm的菌斑，过火焰热固定后备用。其他质控片可选相应的阳性菌株或标本经灭活后制备。

1.3菌株 对细菌(真菌)形态学的正确描述依赖于方法、培养基、培养时间、染色试剂等，培养基和培养时间不同会影响细菌的形态。观察细菌(真菌)的典型形态，应该将细菌(真菌)接种在该菌最适生长的培养基上、放入最适生长环境中(包括温度、湿度和所需气体条件等)进行培养。培养时间应视该菌的生长速度而定，大部分常见的细菌以培养24 h为宜，有些细菌(真菌)需要更长时间的培养才能显现出典型的菌落特征。

1.4显微镜 需要安装图像采集器或照相机的用户，必须准备三目显微镜。

1.5摄影器材 理想图片的获得必须有适合的摄影器材。随着数码时代的到来，各式各样的专业摄影设备应运而生，品种繁多。各实验室应根据实验室条件和经济实力购买适当的摄影器材，最低配置应该至少能拍出达到打印图文报告和出版要求的图片。细菌拍摄用显微镜电子图像采集系统应配置像素不低于1 000万的电子摄像头。在实际工作中，用手机拍摄图片经济、操作简单、方便交流，对基层单位是不错的选择。但是用手机拍摄显微镜下图片时遇到的最大问题是手持拍摄不稳定、抓屏困难、对焦不准，很难拍到符合要求的图片。手持拍摄需要一定的技巧和训练，巧妙寻找支撑点，掌握要领后也可以拍出不错的图片(见图1)。手机拍摄辅助器从简易的纸筒辅助拍摄器(见图2)发展到固定式的辅助拍摄器，如DONGKE LENs辅助拍摄系统(见图3)。

图1 用手机手持拍摄技巧

图2 纸筒辅助拍摄器

1.6摄影基本知识 曝光、对焦和构图是摄影的三要素。以下列出了摄影必须掌握的一些基本知识，更为深入的知识可参阅相关专业书籍[5]。

1.6.1曝光四要素 光线、光圈、快门和感光度。光线越强照片越明亮，光圈越大越明亮，快门越慢越明亮，感光度越高越明亮。

1.6.2光线3个特性 强度、方向和色温。强度是指亮不亮，方向是指光从哪里来，色温是指光源发射光的颜色与黑体在某一温度下辐射光色相同时，黑体的温度称为该光源的色温。

图3 固定式辅助拍摄器

1.6.3光线的3个类型 自然光、场景光和人造光。自然光光谱范围广，色彩还原最佳。场景光往往指拍摄现场所有可用的光源发出的光，光源复杂、强度较弱。人造光是指由人工设计制造的仪器、设备产生的光，如日光灯的光、激光等，常用的人造光设备如闪光灯。

1.6.4景深三要素 光圈、焦距和对焦距离。光圈越大景深越浅，焦距越长景深越浅，对焦距离越近景深越浅(背景越模糊)。

1.6.5感光度 感光度是指胶片或感光器对光的灵敏程度，用ISO表示。感光度越高，对光线越敏感。高感光度下的图像细节损失造成了照片不清晰。相反，感光度低，图像噪点减少，画质细腻。

1.6.6对焦 是指通过改变镜头与感光器之间的距离，让某一个特定位置的物体通过镜头的成像焦点正好落在感光器之上，得出最清晰的影像。对焦不准确，则拍摄的图片不清晰。

1.6.7构图 构图是指如何把人、景、物安排在画面当中以获得最佳布局的方法。构图的目的是对拍摄的主题加以强调、突出。

2 临床微生物图片拍摄方法

临床微生物检验图片拍摄内容主要包括患者的感染部位、标本性状、病原体(寄生虫等)、标本涂片镜检结果(染色或不染色)、菌落特征、纯菌涂片镜检结果(包括菌体的特殊结构等)、生化反应及辅助试验结果、药敏试验及耐药机制检测结果等。对于不同的拍摄对象，要采用不同的拍摄方法进行拍摄。拍摄技巧的掌握与应用可以大幅度提高图片的质量。高质量的图片不仅是把拍摄对象拍清楚，还要求能表现出被拍摄对象细微、典型的特征，这对菌株间的鉴别至关重要。

2.1感染部位拍摄 有些病原体感染人体后会产生特殊的体征，如麻风、皮肤炭疽、猩红热、葡萄球菌皮肤烫伤样综合征、麻疹、干性或气性坏疽、真菌性角膜炎、软下疳、梅毒、鹅口疮、白喉、破伤风、糠秕疹(由马拉色菌引起)、孢子丝菌病(“玫瑰手”)、黄癣(由许兰毛癣菌引起)、黑癣(由紫色毛癣菌引起)、叠瓦癣(由同心性毛癣菌引起)、足肿病、囊虫病、血吸虫病和丝虫病等，对于鉴别诊断具有指导意义。因此对于感染部位的拍摄显得十分重要。

拍摄前需要对感染部位进行评估，选择最具有代表性的部位进行拍摄。要求对焦准确，光线充足。最好是自然光，光线不足时可采用辅助光，如台灯等可移动灯具，或是使用闪光灯，同时注意距离和角度，避免曝光过度。

2.2标本涂片镜检结果拍摄 直接涂片镜检对于感染性疾病病原的诊断有重要的意义，是一种快速、简便有效的微生物检验手段，可为临床医生早期诊断、合理的经验选用抗菌药物提供参考依据。

2.2.1不染色标本拍摄 不染色标本涂片通常采用直接压片法制片，一般只在低倍或高倍镜下观察，很少使用油镜观察。将显微镜的聚光器下调到适当位置，以获得最佳亮度，此时被拍摄对象的轮廓及层次清晰分明。(1)动态视频拍摄：适用于活体标本的直接镜检拍摄，如细菌运动方式、阿米巴滋养体、蓝氏贾第鞭毛虫、滴虫等。要求标本新鲜(必要时保温)，拍摄要稳(建议固定拍摄)，实时调焦(即跟踪拍摄)。(2)图片拍摄：由于没有进行染色，病原体与背景的色差不大，需要调节聚光器，以突出病原体(见图4)。拍摄寄生虫等较大个体时需要注意细节，寄生虫相对于真菌和细菌个体较大，个体长度大于10 mm可直接用微距镜头进行拍摄，但细节表现不会太好，建议在显微镜下拍摄细节部分。由于个体大、厚度高，要想用一个镜头拍摄完整虫体几乎不可能，只能分层拍摄，或是将虫体压扁后进行拍摄。要拍摄虫体器官，必须进行染色。寄生虫拍摄的重点在口器、尾器、交合器和脏器的细节，虫卵拍摄也同样要注重卵内细节，如钩虫卵的卵膜和齿、鞭虫卵的核、蛔虫卵的膜等。

图4 痰液KOH压片见烟曲霉菌丝(×400)

2.2.2染色标本拍摄 拍摄前，先对整张涂片进行观察，选择最具代表性的视野进行拍摄，每个视野可调节不同焦距面进行拍摄，在不同层面上反映出病原体在标本中的状态。对大小不同的拍摄对象应选用不同的物镜头进行拍摄，尽量拍出其完整性(如诺卡菌革兰染色选用100倍物镜头，烟曲霉革兰染色选用20倍物镜头，见图5)。

注：A，诺卡菌(×1 000)；B，烟曲霉(×200)。

图5 痰涂片革兰染色镜检效果

2.3菌落拍摄 细菌和真菌在固体培养基表面生长形成菌落。对菌落进行描述应包括菌落大小、形状、高度、边缘、表面状态、密度(透明度)、菌落内部结构、颜色、光泽以及与培养基表面的黏附程度，还应包括菌落的溶血和色素产生情况等特性。根据菌落特征可对细菌和真菌进行初步鉴定。有些特征是某些细菌和真菌所特有的，具有属或种的鉴别价值，如肺炎链球菌在绵羊血琼脂平板上的脐窝样菌落、伴放线聚集杆菌菌落特殊的内部结构、侵蚀艾肯菌的斗笠样菌落、斯氏假单胞菌皱纹样菌落、变形杆菌迁徙样菌落，酵母、酵母样真菌、丝状真菌等。见图6。

观察细菌和真菌色素的产生，最好在没有颜色的培养基上进行培养，如营养琼脂、MHA、PDA、察氏琼脂等，以减少背景颜色对真实颜色的干扰。拍摄前的构思很重要，要根据不同菌落特性选择不同的拍摄方法，要求拍出菌落的主要特征和局部细节，拍出的菌落不变形，菌落颜色保真，标注放大倍数。对菌落局部细节的拍摄可能要借助放大镜或显微镜来完成，应用辅助光是必须的，最好使用专业光源，也可使用台灯，但要注意颜色的保真，可适时调节白平衡(可设置成自动调节)。平板放置的平台建议选择合适的背景颜色，基本原则是深色平板(如血平板、巧克力平板)用浅色或白色背景；浅色平板选择深色背景，如营养琼脂平板或SDA平板等应该选择黑色或蓝色背景。拍摄大菌落(菌落直径>1 mm)时可拍全平板，拍摄小菌落(菌落直径<1 mm)时最好拍摄菌落分布较均匀的局部。拍摄菌落特征时可针对单个菌落进行拍摄，必要时可借助放大镜或在显微镜下拍摄。拍摄菌落内部结构时需要采用逆光(透射光)进行拍摄。

注：A，肺炎链球菌脐窝状菌落；B,诺卡菌的气生菌丝；C，矮小芽胞杆菌4 ℃生长菌落；D，阿萨希毛孢子菌脑回样菌落。

图6 菌落形态

菌落拍摄难度要大于镜下拍摄，尤其是那些小菌落、凹陷菌落、扩散生长菌落、绒毛样菌落等，自动拍摄很难准确对焦，拍摄时需要运用到很多摄影技术与技巧，加以长期的训练才能拍摄自如，相应的拍摄装置也应运而生。开放式菌落拍摄只需有足够的光线就可以拍摄，其缺点是无法控制污染;半封闭式菌落拍摄装置，可控制光源，拍摄完成后只需进行局部消毒处理，但也无法完全避免污染；封闭式菌落拍摄装置完全符合生物安全需要，不仅有封闭舱门、内置可调节灯光、防反射光板及拍摄角度调节板，兼容手机、相机和图像采集器，而且内设紫外灯管，可随时消毒，见图7。

注：A，开放式菌落拍摄装置；B，半封闭式菌落拍摄装置；C，封闭式菌落拍摄装置。

图7 菌落拍摄装置

2.4纯菌体镜下形态拍摄

2.4.1细菌镜下拍摄 要注意选择菌量适中、染色良好、具有典型形态特征的视野进行，对菌体特殊结构的拍摄要求充分体现出具体特征，如龋齿罗氏菌菌体末端膨大(见图8)、丹毒丝菌菌体呈长链状排列、芽胞的形状及在菌体中的位置及染色特性等(建议在相差显微镜下直接拍摄芽胞，其效果好于芽胞染色)、细菌荚膜的厚度及着色情况、鞭毛的位置和数量等(细菌的鞭毛很细，非常考验拍摄水平，要认真对焦，否则很难拍摄成功)。

图8 龋齿罗氏菌革兰染色(×1 000)

2.4.2真菌镜下拍摄 真菌镜下拍摄也分为不染色和染色2种情况。不染色主要是拍摄真菌自然的生长状态，如对菌落的直接镜下拍摄(见图9)、对小培养的直接镜下拍摄及对假丝酵母菌血清芽管试验的镜下拍摄等。染色标本主要是对丝状真菌乳酸酚棉蓝染色后的镜下形态和对非丝状真菌的革兰染色镜下形态拍摄。拍摄时最好选择各种典型特征汇聚在一起或具有特征性的视野进行拍摄(见图10)。

图9 不染色菌体拍摄(黑曲霉，×100)

图10 互隔链格孢乳酸酚棉蓝染色(×400)

由于真菌个体较大，拍摄时要注意景深，选择合适的物镜头很重要，不同焦距面都要拍下来(见图11)，能够清晰地显示菌丝、足细胞、孢子梗、囊托、分生孢子等。要拍摄出丝状真菌的典型生长状态，最好是选择小培养制片方法。

图11 不同焦距连续拍摄(根霉，×100)

2.5生化反应及辅助试验结果的拍摄 生化反应及辅助试验结果拍摄并不比菌落的拍摄容易，根据不同的试验结果需要使用不同的拍摄技术。比如拍CAMP和半固体动力试验结果时选用逆光的效果最佳，拍摄荧光素检测结果和紫外线吸收试验结果时要用紫外光线等。

2.6药敏试验及耐药机制检测结果的拍摄 拍摄需要用肉眼判断结果的药敏试验及耐药机制检测结果时，必须能够在图片中如实反映出结果的细节部分，使读者能够根据图片也能准确判定结果。如应注意药敏试验结果中的弱生长现象，耐药机制检测试验结果中的抑菌圈边缘试验(见图12)、协同或抑制试验等。

注：A，沙滩样；B，悬崖样。

图12 抑制圈边缘试验结果

3 临床微生物图片拍摄技巧

3.1色彩还原准确 色彩还原准确指拍摄的彩色图片的色彩，大体上和原景物的色彩相一致。影响色彩还原的因素有相机的性能、白平衡的设置、摄影镜头的质量、光线的色温等，自然光能最好地还原图像的真实色彩。

3.2比例尺 要准确地反映被拍摄物体的真实大小，最简单有效的办法就是在图片上标明比例尺。有些专用的相机及显微镜配有比例尺，但一般的设备不具备，也可通过目镜测微尺加以标示(见图13)。这就要求拍摄者在拍摄时注意记录拍摄时的放大倍数，当然不只是物镜乘以目镜放大倍数这么简单，实际上还需要注意相机变焦及图片后处理时的裁剪等因素，总之要尽可能准确，并在图片中注明放大倍数。

图13 目镜测微尺

3.3光线运用 摄影就是光的艺术，不会用光是拍不出好的作品。尤其是对菌落的拍摄，应该根据菌落实际的特征以及拍摄者要反映出的效果来选择用光，侧光(见图14)和逆光(见图15)也是常用的手段，运用好能拍出极佳的效果。

注：A，青霉菌黏液珠；B，芽胞杆菌。

图14 侧光拍摄效果

注：A,反射光拍摄；B，透射光(逆光)拍摄。

图15 伴放线聚集杆菌菌落拍摄效果

4 临床微生物检验图片拍摄注意事项

4.1对拍摄者的健康要求 拍摄者的体检结果应符合医学检验从业人员的体检标准[6]，色盲、色弱者不适合进行彩色图片的拍摄工作。

4.2保证图片质量 一张合格的图片应该是图像清晰、色彩逼真、主题突出、背景干净、像素符合要求。图像清晰主要是要求对焦和曝光准确、防颤抖，色彩逼真要求拍摄辅助光接近自然光、适时调准白平衡，主题突出就是要把最具典型特征的部位放在醒目位置，必要时加箭头指示。拍摄菌落和其他辅助试验时是要注意保持背景干净，避免出现窗户、门框、桌椅等，平板背面尽量不要用记号笔写字，否则影响观察菌落的颜色、溶血等特征。

4.3生物安全 所有拍摄过程均要符合实验室生物安全要求。拍摄菌落最好在生物安全柜中进行，摄影器材不要带出实验室，图片可通过实验室电脑进行传输。如果使用手机进行拍摄，最好是实验室配置的专用手机，个人的手机严禁带入实验室。

4.4兴趣培养与技能训练 建议拍摄者日常多在自然状态下进行拍摄训练，尤其是对微距拍摄的训练，如拍摄花、鸟、鱼、虫等小的景物，既可培养兴趣，又可以将实战技巧运用于实际工作中来，拍出用于日常工作、学习交流、发表论文等更好的图片。

[1]陈东科. 加强形态学检查提高细菌鉴定的准确性[J]. 实验与检验医学, 2012, 30(5): 419-421.

[2]中国医师协会检验医师分会感染性疾病检验医学专家委员会. 临床微生物检验诊断报告模式专家共识[J]. 中华医学杂志，2016，96(12)：937-939.

[3]魏莲花，邹凤梅，刘刚，等. 临床微生物形态学及特殊耐药性检测室间质量评价体系的建立及应用[J]. 临床检验杂志，2017,35(7)：538-541.

[4]陈东科，孙长贵．实用临床微生物学检验与图谱[M]. 第1版.北京：人民卫生出版社，2011.

[5]美国纽约摄影学院. 美国纽约摄影学院摄影教材[M]. 北京：中国摄影出版社，2010.

[6]中国合格评定国家认可委员会. CNAS-CL42:医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用说明[S/OL]. 2012：3(2015-11-11)[2017-09-05]. https://www.cnas.org.cn/images/rkgf/sysrk/rkyyzz/2015/12/21/64DBFD05D574C2DD479FDB6E82F75FAF.pdf.

2017-05-15)

(本文编辑：刘群)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.10.03

陈东科，1961年生，男，副主任技师，擅长微生物形态学检查与图片拍摄。

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