特敏增强荧光染色法在浅部真菌病诊断中的应用*

罗云鹏，高仰敏，金云，江情，李婕，樊心怡，占萍

(江西省皮肤病专科医院真菌科，南昌 330001)

·临床检验技术研究·

特敏增强荧光染色法在浅部真菌病诊断中的应用*

罗云鹏，高仰敏，金云，江情，李婕，樊心怡，占萍

(江西省皮肤病专科医院真菌科，南昌 330001)

目的评价特敏增强荧光染色法在浅部真菌病诊断中的应用价值。方法对200例临床高度怀疑真菌感染的标本分别用特敏增强荧光染色法、钙白荧光染色法和传统的1.78 mol/L KOH湿片法对真菌进行镜下形态学观察，并比较真菌检出率。结果特敏增强荧光染色法视野背景干净，菌丝及孢子均为亮蓝色，真菌的形态结构清晰易辨。特敏增强荧光染色法检出率高于钙白荧光染色法和KOH湿片法(χ2=17.984，P<0.05；χ2=32.063，P<0.05)。结论荧光染色法是一种快速有效的真菌染色镜检技术，在临床实验室早期诊断真菌病中有推广价值。

特敏增强荧光染色法；真菌镜检；KOH湿片法；钙白荧光染色法

KOH湿片法是目前国内最常用的真菌镜检方法，KOH方法简单方便，成本低廉，但主观性强。该溶液对真菌成分无着色效果，而浅部标本(特别是甲屑和毛发标本)因含有各种杂质(纤维、皮屑、细胞等)常导致背景杂乱，不易分辨真菌结构，镜检阳性率普遍不高[1]。此外，该法对于特殊标本(患者用药后标本和毛囊炎标本)，极易造成漏诊。钙白荧光染色法(calcofluor white)是国外常用的镜检方法，但由于染色剂与真菌结构为非特异性结合[2]，在荧光显微镜下观察不仅真菌结构呈亮蓝色，背景也呈蓝色，导致真菌结构与之对比不够明显，观察较为费力。本科室近期开展了一种新型特敏增强荧光染色法，通过荧光素标记的重组几丁质酶与真菌细胞壁的多糖或几丁质结合，在荧光显微镜下观察真菌结构。本研究收集200例高度疑似浅部真菌感染病例，同时与常用的钙白荧光染色法和传统KOH湿片法进行对比，以探讨此方法在早期诊断真菌感染中的优势，现报道如下。

1 材料与方法

1.1标本来源 取自2017年4月10日至6月1日期间到本院门诊就诊、临床拟诊为真菌感染的浅部真菌病患者，共200例。根据标本来源分为皮屑(包括毛囊炎)146例，甲屑38例，毛发16例。

1.2试剂与仪器 特敏增强荧光染液(一滴法，江苏莱芙时代生物科技公司)；钙白荧光染色剂(终浓度0.1 mg/L，Sigma公司)；1.78 mol/L KOH溶液自配。奥林巴斯CX31显微镜(增加荧光模块，奥林巴斯公司)。

1.3方法

1.3.1取材 皮屑标本：先用75%酒精消毒皮损部位，使用钝头刀片刮取皮损炎性活动性边缘的鳞屑，将标本置于载玻片上。甲屑标本：75%酒精消毒坏甲部位，刮取甲下碎屑置于载玻片上。毛发标本：使用镊子拔取病发直接置于载玻片上。毛囊炎标本：先用75%酒精擦拭皮损部位，再用无菌尖头手术刀的尖端挑破脓疱顶端，向内用力挤压即可取出毛囊内乳酪状内容物，将标本置于载玻片上。将同一患者同一部位取出的标本分为等量3份，分别用于特敏增强荧光染色法，钙白荧光染色法和KOH湿片法检测。

1.3.2染色及镜检 特敏增强荧光染色法：在载有标本的载玻片上滴加1滴特敏荧光染液，盖上并轻压盖玻片，在荧光显微镜下观察、拍照。钙白荧光染色法：在载有标本的载玻片上滴加1滴钙白荧光染液，然后再滴加1滴1.78 mol/L KOH，1 min后盖上并轻压盖玻片，在荧光显微镜下观察、拍照。KOH湿片法：在载有标本的载玻片上滴加1滴1.78 mol/L KOH溶液，盖上并轻压盖玻片，并在酒精灯火焰上方微微加热，在光学显微镜下观察、拍照。每张片子至少选取4个视野进行观察(即每张片子有标本覆盖的地方全部会在显微镜视野中进行观察)，若有菌丝或者较多孢子(毛囊炎标本一般认为每油镜视野大于5个[3])就判定为阳性，否则判定为阴性。200例标本所用试剂为同一厂家同一批次产品。另外，参与该课题的3位检验人员均为工龄超过5年以上且有丰富的临床检验经验的一线实验技术员，主观误差(人间误差)在可控范围内。

1.4统计学分析 用SPSS 23.0软件进行。3种镜检方法的检出率比较用卡方检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1镜下形态学观察 对200例标本分别采用特敏增强荧光染色法、钙白荧光染色法和KOH湿片法检测，结果显示特敏增强荧光染色法视野背景干净，菌丝及孢子均为亮蓝色，真菌的形态结构非常清晰，容易辨别，不易漏检。癣菌标本表现为细长规则分支分隔的柔滑菌丝，毛发标本可见头发内外的规则分支菌丝和链状排列的圆形小孢子，甲屑标本常见分支分隔的菌丝、关节菌丝和孢子，花斑糠疹标本为短棒状弧形菌丝和出芽孢子，马拉色菌毛囊炎标本可见卵圆形、宽底的出芽孢子，念珠菌标本为链状、分支处缩窄的假菌丝、圆形或椭圆形出芽孢子。见图1和图2A。

注：A，皮屑标本，皮肤癣菌细长菌丝；B，毛发标本，发内外菌丝及孢子；C，甲屑标本，菌丝和关节孢子；D，皮屑标本，马拉色菌弧形菌丝和出芽孢子；E，皮屑标本，马拉色菌出芽孢子；F，皮屑标本，念珠菌假菌丝和出芽孢子。

图1 皮屑标本、甲屑标本和毛发标本特敏增强荧光染色法真菌镜检染色(×400)

钙白荧光染色法也可清晰检测到亮蓝色的菌丝及孢子，但背景很亮，干扰较强，与真菌结构对比不甚清晰，见图2B。而KOH湿片法背景杂乱，菌丝和孢子与背景对比不清晰，真菌形态不易辨别，见图2C，特别是甲屑标本，仅含少量孢子的标本更难判断。在相同时间内，与KOH湿片法相比，荧光染色法更易观察真菌结构。

注：A，特敏增强荧光染色法；B，钙白荧光染色法；C，KOH法。

图2 3种方法直接镜检形态学结果对比(×400)

2.23种镜检方法的检出率比较 统计结果显示，200例临床可疑感染患者中，特敏增强荧光染色法检出192例阳性标本(96%)，钙白荧光染色法检出166例阳性标本(83%)，而KOH湿片法检出153例阳性标本(76.5%)，特敏增强荧光染色法阳性检出率明显高于KOH湿片法(χ2=32.063，P<0.05)，也高于钙白荧光染色法(χ2=17.984，P<0.05)，钙白荧光染色法和KOH湿片法检出率差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 3种真菌镜检方法检出率比较[n(%)]

3 讨论

特敏增强荧光染色液是一种含有高纯度荧光素和特定比例的背景光压制溶液的复合溶液，一方面通过荧光素标记的几丁质重组酶与真菌细胞壁中的几丁质特异性结合，形成强荧光复合物，借助荧光显微镜，在紫外光(波长340～380 nm)或者蓝紫光(波长420～490 nm)激发下，仅真菌结构发出亮蓝色的荧光；另一方面，该溶液中有KOH成分，能溶解皮屑及甲屑标本中的角质细胞及去除背景中的干扰荧光，使真菌菌丝及孢子染色更为突出，与视野中的背景形成强烈的反差，便于辨别。另外，该方法新手容易掌握，其操作方法与KOH湿片法一致，只需要一滴法，简单，耗时短，结果直观，同时也弥补了KOH湿片法对疑难标本(儿童颈部念珠菌感染标本，色减型花斑糠疹皮损、菌载量少的标本，材质比较厚的甲屑标本，外涂药膏的标本等)易出现假阴性的缺憾。根据我们临床实验室的数据统计和经验，与KOH湿片法相比，特敏增强液染色法显著提高了标本的镜检阳性率。

本实验室收集的标本主要为浅部真菌标本，证实特敏增强荧光染色法为一种简单快速有效的真菌检测方法。已有文献报道荧光染色法在甲真菌病检测中的应用价值[4]。此外，荧光染色法也可用于新鲜或者冰冻组织切片中的真菌检出[5]以及深部标本的诊断[6]。因此，需要开展针对深部标本的应用，以了解该染料对其他类型标本的检测效果。

[1]费实, 肖常青, 李振洁,等. 1999～2007年皮肤科门诊浅部真菌发病及镜检情况分析[J]. 中国真菌学杂志, 2009, 4(2):93-96.

[2]Roncero C, Valdivieso MH, Ribas JC,etal. Effect of calcofluor white on chitin synthases fromSaccharomycescerevisiae[J]. J Bacteriol, 1988, 170(4):1945-1949.

[3]李智华, 耿承芳, 江清,等. 花斑糠疹和马拉色菌毛囊炎菌种分布特点分析[J]. 中国皮肤性病学杂志, 2010, 24(5):429-430.

[4]Idriss MH, Khalil A, Elston D. The diagnostic value of fungal fluorescence in onychomycosis[J]. J Cutan Pathol, 2013, 40(4):385-390.

[5]杨通, 何炼图, 陈涛,等. 荧光染色剂Calcofluor White在活检组织中真菌染色的应用[J]. 分子诊断与治疗杂志, 2014, 6(5):307-311.

[6]韩德忞, 刘原志, 朱均昊,等. 荧光染色法与KOH湿片法在真菌直接镜检中的应用比较[J]. 中国真菌学杂志, 2016, 11(4): 240-242.

2017-07-12)

(本文编辑：刘群)

Fluorescentstainingwithhypersensitivityandenhancementforearlydiagnosisofsuperficialfungalinfection

LUOYun-peng,GAOYang-min,JINYun,JIANGQing,LIJie,FANXin-yi,ZHANPing

(DepartmentofFungiSection,DermatologyHospitalofJiangxiProvince,Nanchang330001,Jiangxi,China)

ObjectiveTo evaluate the application of novel fluorescent staining method with hypersensitivity and enhancement for microscopic examination of superficial fungal.MethodsA total of 200 cases with clinically suspected superficial fungal infection were screened by the hypersensitive, enhanced fluorescent staining, calcofluor white staining and microscopic examination with 1.78 mol/L potassium hydroxide (KOH) based smear assay, respectively. The positive percentages of the different methods were calculated and compared.ResultsIn the developed fluorescent staining examination, clean background was shown in the view field. The hyphae and spores displayed in bright blue, thus fungal morphology was so distinct that they were easy to be distinguished. Compared with calcofluor white staining and KOH based smear, the fluorescent staining showed high positive rate with significant difference respectively (χ2=17.984,P<0.05;χ2=32.063,P<0.05).ConclusionThe novel fluorescent staining should be a rapid, accurate method for microscopic examination of fungi, which is worthy to be widely used in clinical laboratories for early diagnosis of fungal infection.

hypersensitive, enhanced fluorescent staining; fungal direct microcopic examination; potassium hydroxide based smear assay; calcofluor white staining

10.13602/j.cnki.jcls.2017.10.04

国家自然科学基金青年基金项目(13008316)。

罗云鹏，1989年生，男，技师，大学本科，从事真菌检验工作；高仰敏，1989年生，女，研究实习员，硕士，从事真菌药物敏感性和致病分子机制研究。两位作者同为第一作者。

占萍，主治医师，博士，E-mail:zhanping1980@163.com。

R446.5

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