全封闭一次性小培养基的研制及其在丝状真菌小培养中的应用

陈东科，邓存兴，许宏涛

(1.北京医院检验科，北京 100730；2.珠海美华医疗科技有限公司，广东珠海 519000)

·临床检验技术研究·

全封闭一次性小培养基的研制及其在丝状真菌小培养中的应用

陈东科1，邓存兴2，许宏涛1

(1.北京医院检验科，北京 100730；2.珠海美华医疗科技有限公司，广东珠海 519000)

目的研制一种安全实用的一次性真菌小培养基。方法参照钢圈小培养法原理。底板选用透明度高的PVC为原材料，同常规使用的载玻片大小(25.2 mm×75.9 mm×1.05 mm)，板面两端磨砂设计；圆形培养皿直径19.4 mm，侧面高3.75 mm，其上接种孔直径为2.4 mm，可随用户需求灌注PDA琼脂等培养基，加孔塞封闭；上封盖片采用钢化玻璃制成。一次性真菌小培养基用培养湿盒进行保存，两端水槽内加海绵条，加盖密封盖。分别观察临床丝状真菌在该全封闭一次性小培养基中的生长状况、镜下形态及染色效果以及培养基的保存效果。结果该全封闭一次性小培养基实际应用效果良好，真菌生长状况可视、色素明显，镜下可观察到真菌原生态生长形态，可直接进行染料灌注染色，且效果良好。培养基包装后于4 ℃保存3个月后外观不变，量未见减少。结论成功研制一种操作简单、透明度高、密封效果好、培养性能可靠、生物安全性高的全封闭一次性小培养基。可随时在镜下观察生长状况、适用于油镜下直接观察、可直接进行棉蓝染色，临床试用效果良好，适用于各级实验室的真菌形态学检查。

真菌小培养基；全封闭；一次性使用

真菌培养鉴定是传统的用于真菌感染检测的方法，除少数真菌培养不成功外，多数真菌能人工培养。真菌培养鉴定的目的是提高病原真菌检出的阳性率、确定病原菌的种类、进行药敏试验，为临床诊断及选药治疗提供可靠的依据。依现在的科技水平，通过生化鉴定、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱、分子生物学及DNA测序等方法可对真菌进行准确鉴定，但是在实际工作中绝大多数临床实验室对丝状真菌还是以形态学鉴定为主要手段，尤其在不具备高端检测设备的基层实验室。因此，观察真菌菌落形态、颜色变化及真菌不同生长时期的镜下特征(菌丝、孢子及特殊结构的形态)对正确鉴定真菌具有重要意义[1-2]。本文介绍并评价一种安全实用的全封闭一次性真菌小培养基(专利号：2016211258280)，供广大读者参考。

1 研发背景

1.1各种小培养方法的优缺点 丝状真菌的培养方法可分为试管法、平板法(大培养)和小培养法，其中小培养法主要用于菌种鉴定。小培养法大致分为以下3种。(1)玻片法：该方法主要用于念珠菌的厚壁孢子和假菌丝鉴别，也可用于丝状真菌培养，缺点是开放性操作、污染严重；(2)琼脂块法：该方法适用于丝状真菌显微镜下形态学的观察，缺点是开放性操作、污染严重，琼脂块法能保持菌体的完整性但不适用于快速产菌丝的真菌；(3)钢圈法：该方法适用于丝状真菌显微镜下形态学的动态观察，优点是形成一种封闭式培养，在显微镜下直接观察菌落时可避免孢子进入空气中或吸入人体，不易被空气中的真菌污染，盖玻片也可取下染色后封固制片保存，缺点是操作较繁琐、易致杂菌污染培养基、稍不小心常会压破盖玻片而损坏标本并造成显微镜污染。

1.2各种丝状真菌染色方法的优缺点 临床实验室常用的丝状真菌染色制片法主要有透明胶带粘片法和琼脂块小培养揭片法[3]。透明胶带粘片法的优点是操作方便，缺点是开放性操作、污染无法控制、粘起来的菌体结构不完整、胶带与载玻片间的间隙无法控制而造成镜下观察时图片采集困难(菌体不在同一焦面上)，见图1。琼脂块小培养揭片法的优点是能保持菌体形态的完整及真菌生长状态的原生态展现，缺点是开放性操作，污染无法控制。

注：A,层生镰刀菌,孢子脱落严重;B,毛壳菌菌体形态不完整;C,犁头霉,孢囊清晰梗基模糊。

图1 透明胶带粘片法的形态学观察(×400)

2 全封闭一次性小培养基

2.1设计要点 参照钢圈小培养法原理。见图2。

图2 一次性小培养基全貌

2.1.1基本材料及尺寸大小 全骨架使用PVC材料制作，提升安全性能；底板与普通载玻片大小厚薄一致，大小为25.2 mm×75.9 mm×1.05 mm，便于固定在显微镜载物台上；板面两端设计为磨砂面，方便记录菌株信息。

2.1.2核心结构 培养皿设计为圆形，高3.75 mm、直径19.4 mm；接种孔直径为2.4 mm，封孔加塞保湿；上封盖片采用钢化玻璃制成，可使用油镜观察，透明性及安全性能高；培养基可随用户需求进行灌注，通用型为PDA琼脂；底板为高透明度的PVC材料，可随时观察菌丝、产孢及特殊结构，也满足拍摄的需要。

2.1.3保存 采用培养湿盒保存。湿盒两端水槽内加海绵条，加密封盖保存。培养盒经过消毒液浸泡后可重复使用。见图3、图4。

图3 保湿盒设计

图4 密封盖设计

2.2接种方法 接种方法同钢圈法。要求接种单一菌种，尽量靠近上板面接种(见图5)，方便镜检。如果标本直接涂片见到可疑为真菌又无其他杂菌时，可直接挑取可疑部分接种在一次性小培养基上进行培养(见图6)。接种后对接种孔进行加塞封口，然后放入培养盒，加无菌水于培养盒两端的海绵槽内，盖好封盖放入培养箱。

图5 小培养接种

图6 直接接种镜检阳性的痰标本

3 临床应用

3.1生长状况观察 对生长快的真菌每天进行生长状况观察，慢生长菌可每3天或一周观察一次，每次观察时最好用镊子拔起孔塞进行氧的置换，而后即刻塞紧(见图7)。对有明显生长的真菌要记录生长状况，如气生菌丝、基生菌丝、菌落颜色等(见图8)，并记录培养时间、温度等信息。

图7 拔塞通气

注：A，气生菌丝；B，基生菌丝(阿萨希毛孢子菌)；C，马尔尼菲蓝状菌96 h产酒红色素； D，枝孢霉7 d黑色菌落；E，黄曲霉(72 h)；F，塔宾曲霉(48 h)。

图8 真菌生长菌丝及色素状况观察

3.2镜下形态观察 对肉眼看到有菌落生长的真菌应每天(或隔天)在镜下进行观察，无孢子及特殊结构产生的应继续培养，有产孢或特殊结构的应拍照记录，并与图谱进行比对，形态相同或接近的可作为初步鉴定的依据(见图9)。同时记录产孢的时间、温度等信息。

3.3染色及效果观察 对需要进行染色观察的真菌，可直接从接种孔加乳酸酚棉蓝染液进行染色(见图10)，待染液渗入琼脂后(或吸出多余染液)进行镜检(见图11)。

3.4保存密封效果 培养基包装后于4 ℃保存3个月后观察，培养基外观不变，量未见减少(即水份未蒸发)。

图9 真菌镜下形态观察

图10 直接乳酸酚棉蓝染色

图11 真菌染色后形态观察

4 讨论

医学真菌学检查是诊断真菌病的重要依据，不论是对浅部或深部感染的诊断，必须依赖于临床标本的常规和特殊检查。常规检查法主要包括：形态学检查(直接镜检+染色镜检)、培养检查和组织病理学检查。特殊检查主要包括血清学方法和分子生物学方法。《人间传染的病原微生物名录》中规定，除了少数高致病性真菌需要在BSL-3级实验室操作外，其余真菌均应该在BSL-2级实验室操作。《P2实验室的建设与使用指南》中要求，对所有开放性操作都应在Ⅱ级生物安全柜中进行。《侵袭性真菌临床实验室诊断操作指南》[4]要求，开展侵袭性真菌实验室检验必须在具备Ⅱ级生物安全防护的实验室中进行，指南中推荐的琼脂块小培养法及透明胶带粘菌法都属于开放性操作，对生物安全柜、实验室环境及实验人员的防护都是严峻的考验。

全封闭一次性小培养基的设计充分考虑了以下方面。上封盖片采用了钢化玻璃材料，一是为了油镜可视，因为PVC材料最薄只能做到0.8 mm厚，超出了油镜头的聚焦范围；二是可脱油后继续培养，因为PVC材料可被各种脱油剂不同程度的溶解，严重影响其透明度；三是确保不易破碎，提高生物安全防护，而普通盖玻片易碎不安全。考虑到培养基量少、培养时间长的因素，设计为小接种孔、加塞保湿；为最大限度地降低真菌外溢污染和环境菌对培养基的污染，采取了加塞和加密封盖的双重保险措施；还可根据用户需求加不同培养基，通用培养基为PDA；选用低成本的PVC材料做小培养可降低成本，实现一次性使用，从而减少了配制及制作培养基的环节，解决了微生物实验室人员普遍不足的实际问题，也极大地促进了规范化操作进程。

[1]陈东科，孙长贵. 实用临床微生物学检验与图谱[M]. 北京：人民卫生出版社, 2011.

[2]王端礼. 医学真菌学-实验室检验规范[M]. 北京：人民卫生出版社,2005.

[3]陈东科.湿片封片技术在临床微生物镜检中的应用[J].临床检验杂志,2017,35(1):42-44.

[4]国家卫生和计划生育委员会. WS/T497-2017.侵袭性真菌病临床实验室诊断操作指南[S]. 北京：中国标准出版社，2017.

2017-06-27)

(本文编辑：刘群)

Developmentoftotallyenclosedslideculturemediumanditsapplicationinfilamentousfungiculture

CHENDong-ke1,DENGCun-xing2,XUHong-tao1

(1.DepartmentofLaboratoryMedicine,BeijingHospital,Beijing100730; 2.ZhuhaiMeihuaMedicalTechnologyLimited,Zhuhai519000,Guangdong,China)

ObjectiveTo develop a safe, practical, disposable slide culture medium for fungi culture.MethodsBased on the principle of traditional slide culture medium with small steel ring, a plate of polyvinyl chloride (PVC) with high transparency was chosen as the bottom material of the new medium which held the size of the conventional slide (25.2 mm×75.9 mm×1.05 mm) with frosted design at both ends. The diameter of inoculation hole was 2.4 mm on the rounded culture dish which was designed with diameter of 19.4 mm and side height of 3.75 mm. The users could inject potato dextrose agar (PDA) or other medium into the culture dish as needed and then sealed it with a plug. The upper cover was prepared with toughened glass. The improved disposable slide culture medium should be kept in humidifying box with sponge strips in the water tanks of both sides and sealed with cap. The growth status, microscopic morphology and staining result of filamentous fungi in the totally enclosed slide culture medium were observed and the preservative status of the prepared medium was also monitored simultaneously.ResultsThe effects of the improved slide culture medium were satisfactory in clinical practical application. The growing status of fungi could be observed visually and the pigment was clear. The original growth form of fungi could be monitored under microscope and dye material could be perfused directly to stain with good results. The appearance and the volume of packaged slide medium were unchanged after preservation at 4 ℃ for 3 months.ConclusionAn improved slide culture medium was successfully developed, which should be easy to operate, high visible, satisfactory for sealing effects and reliable for culture performance with high biological safety. The growth status of fungi could be observed under microscope at any time, and the medium could also be monitored under oil immersion lens directly and stained with cotton blue. The improved medium could be used in morphological examination for fungi in different levels of medical laboratories since its favorable results in clinical application.

slide culture medium for fungi; totally enclosing; disposable application

10.13602/j.cnki.jcls.2017.10.05

陈东科，1961年生，男，副主任技师，擅长微生物形态学检查与图片拍摄。

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