临床常见曲霉形态学鉴定

徐和平，黄江山

(厦门大学附属第一医院检验科，福建厦门 361003)

临床常见曲霉形态学鉴定

徐和平，黄江山

(厦门大学附属第一医院检验科，福建厦门 361003)

曲霉感染发生率居系统性真菌感染的第二位，快速准确检测和鉴别曲霉具有重要的临床意义。目前曲霉鉴定方法包括传统的形态学鉴定、质谱、DNA序列分析等技术。对于广大的临床微生物实验室而言，曲霉的形态学鉴别还是目前主要的鉴定手段。该文介绍当前曲霉的分类进展，用图文结合的方式详细描述标本中曲霉的菌丝形态、培养条件、各属形态学特点，对临床微生物学实验室鉴定曲霉有参考和指导价值。

曲霉；分类；培养；形态学

曲霉(Aspergillus)在自然界广泛存在，种类众多(约180多种)。其中少数为机会致病菌，可引起人类的曲霉病，导致肺部(侵袭性曲霉病、肺曲霉球、超敏反应等)、外耳道、皮肤、指甲、骨骼等部位感染。少数的菌株还可产生曲霉毒素(黄曲霉毒素等)，引起中毒、肿瘤发生。由曲霉导致的感染发生率在系统性真菌感染中居第二位，仅次于念珠菌，且发病隐匿，进展迅速，临床症状和影像学不够典型和特异，缺乏安全有效的抗真菌治疗手段，病死亡率高，故早期、快速、正确地鉴定出曲霉感染，对目标治疗具有重要的临床意义。目前曲霉鉴定除传统的形态学鉴定外，已经开始应用质谱、DNA序列分析等技术。但质谱、DNA序列分析目前存在仪器价格昂贵，标本的培养与制备未标准化、参考数据菌库的建立还需要完善，以及外送检验时效性差等诸多因素限制了其在广大基层医院的应用。对于广大的临床微生物实验室而言，曲霉的形态学鉴别还是目前主要的鉴定手段。本文将从曲霉的形态特点、培养条件等方面进行阐述，以期对临床微生物学实验室鉴定曲霉有参考和指导价值。

1 曲霉的分类

曲霉隶属于真菌界(Fungi)、子囊菌门(Ascomycota)、子囊菌亚门(Pezizomycotina)、散囊菌纲(Eurotiomycetes)、散囊菌目(Eurotiales)、发菌科(Trichocomaceae)、曲霉属(Aspergillus)。最近，通过多基因法的系统发育学分析，对核糖体基因转录间隔区(ITS)、β-微管蛋白(β-tubulin)、钙调节蛋白(calmodulin)、肌动蛋白(ACT)、RNA聚合酶Ⅱ(RPB2)等基因位点分型，把曲霉分为5个亚属(subgenera)：曲霉亚属(Aspergillus)、烟曲亚属(Fumigati)、环绕亚属(Circumdati)、巢状亚属(Nidulantes)和华丽亚属(Ornati)，这5个亚属又分为16个组(section)：烟色组(Fumigati)、棒状组(Clavati)、局限组(Restricti)、曲霉组(Aspergillus)、亮白组(Candidi)、黑色组(Nigri)、环绕组(Circumdati)、黄色组(Falvi)、黄柄组(Flavipedes)、土生组(Terrei)、焦色组(Usti)、杂色组(Versicolores)、构巢组(Nidulantes)、鹿皮色组(Cervini)、稀疏组(Sparsi)、Cremei组(Cremei)[1]。过去使用的复合群(complex)的分类逐渐被更为准确的组和分支(clade)所替代。

2 标本直接镜检

组织标本、痰、气管抽吸物、肺泡灌洗液、耳道分泌物以及其他样本，可以采用革兰染色、KOH、荧光白染色、六胺银染色(GMS)、HE染色、PAS染色等方法检测曲霉菌丝，但直接镜检阳性率比较低。对于高度怀疑曲霉感染患者，可以使用10% KOH消化后离心浓缩镜检以提高阳性率。使用GMS、HE、PAS染色等病理染色技术时，注意避免标本研磨，因为活体的菌丝通常呈嗜碱性或双染色性，而死亡或损害的菌丝因细胞壁损坏常为嗜酸性[2]。曲霉在组织中主要以菌丝形态表现，菌丝通常为透明、分隔、45°锐角分枝；在病理组织标本中呈平行或放射状扩散于整个组织中，在肺曲霉球患者可见菌丝成团；在与空气直接接触的耳道、气道标本中有时可见曲霉头。见图1。

3 曲霉培养

大部分曲霉生长要求不高，在血平板、巧克力平板、中国蓝平板、沙氏培养基(SDA)、马铃薯葡萄糖培养基(PDA)均可以生长，而大部分曲霉科玛嘉显色培养生长十分局限。不同培养基上曲霉生长成熟的速度相差较大，以SDA和PDA生长成熟最快。因此临床上为准确快速分离鉴定出曲霉，建议镜检阳性标本常规接种SDA和PDA，而不应使用科玛嘉显色培养基作为丝状真菌初代培养基。曲霉在25～37 ℃ 均可生长，但同样存在生长速度的快慢不一，因此建议同时放置25 ℃ 和35 ℃ 两个温度培养，见图2、图3。湿度对曲霉的生长影响较小，但为防止培养基长期培养干枯开裂而影响曲霉生长，故保持一定的湿度环境还是有必要。

部分曲霉需要提供高渗培养条件才能促进其生长和产孢(如局限曲霉)，可以把SDA和PDA的含糖量(葡萄糖或蔗糖)从20 g/L提高到200 g/L，将明显加快该类曲霉的生长速度。部分曲霉耐受高温，可以相应提高生长温度(45 ℃)，以达到鉴别诊断目的。

注：A，痰标本，KOH,×400；B，肺泡灌洗液，革兰染色，×1 000；C，肺泡灌洗液，抗酸染色，×1 000；D，肺泡灌洗液，六胺银染色，×1 000；E，耳道标本，荧光白染色，×400；F，耳道标本，革兰染色，×400；G，肺组织，六胺银染色，×400；H，肺组织，HE染色，×400；I，肺组织，PAS染色，×400。

图1 组织及体液标本中曲霉直接镜检

图2 烟曲霉在不同培养基和温度培养48 h生长对比

注：A，土曲霉科玛嘉显色培养基，35 ℃ 培养6 d；B，烟曲霉科玛嘉显色培养基，35 ℃ 培养6 d；C，烟曲霉科玛嘉显色培养基背面，35 ℃ 培养6 d；D，杂色曲霉,PDA，28 ℃ 培养6 d；E，杂色曲霉，PDA，35 ℃ 培养6 d；F，杂色曲霉, 科玛嘉显色培养基，35 ℃ 培养6 d。

图3 不同培养条件下曲霉生长情况

4 曲霉的形态鉴定

曲霉可以从菌落和镜下形态特征来鉴定。菌落可从生长速度、质地、沟纹、高度、边缘形态、正反面颜色、色素和渗出液等方面观察。曲霉的生长速度较快，一般72 h内成熟，但亦有部分菌株生长比较缓慢。菌落初期通常为白色，之后，因不同的菌种变成绿色、黄色、黑色或棕褐色，质地粉状，背面通常为白色或褐色。镜下形态主要从菌丝形态、足细胞、分生孢子头、分生孢子、壳细胞、菌核、闭囊壳等方面进行辨别。曲霉菌丝有隔、无色透明或呈明亮的颜色，但不呈暗色。分生孢子梗茎以大体垂直的方向从足细胞生出，不分支，梗茎光滑或粗糙。其顶端膨大形成不同形状的顶囊，从其表面形成产孢细胞。产孢细胞有单层和双层之分，单层是自顶囊表面生出一层安瓿状瓶梗(小梗)，再在其上形成分生孢子；双层是自顶囊表面先生出一层上大下小的柱形细胞，成为梗基，由梗基上产生瓶梗，瓶梗上再形成分生孢子。分生孢子为单细胞，具有不同形状和各种颜色，光滑或粗糙有棘，连接成不分支的链状。由顶囊到分生孢子链构成不同形状的分生孢子头，呈现不同颜色。有的种可形成厚壁的壳细胞，形状因种而异；有的种则可以形成菌核或类菌核结构；还有的种产生有性阶段，形成闭囊壳。闭囊壳是一个体积较大、圆形、封闭的多细胞结构的子实体，表面为紧密交织菌丝包裹，其内含子囊和子囊孢子，子囊孢子大多透明或具有不同颜色、形状和纹饰[3]。菌核是由菌丝紧密连接交织而成的休眠体，内层是疏松组织，外层是拟薄壁组织，形成壁厚、色深、较坚硬菌丝体颗粒。菌核的功能主要是抵御不良环境，可耐高温，低温及干燥保存。当环境适宜时，菌核能萌发产生新的营养菌丝或从上面形成新的繁殖体。临床常见曲霉形态学特点[4-18]见表1，示意图见图4-13。

表1 常见曲霉鉴定索引表

注：A，PDA，28 ℃ 2 d；B，中国蓝平板，28 ℃ 2 d；C，白色烟曲霉，PDA，28 ℃ 10 d；D、E，分生孢子头，乳酸酚棉蓝染色，×400；F，分生孢子头，乳酸酚棉蓝染色，×1 000。

图4 烟曲霉

注：A，PDA, 28 ℃ 7 d; B，血平板,28 ℃ 5 d; C，菌核(箭头所示黑色颗粒)，SDA,28 ℃ 21 d; D，分生孢子头,单层小梗(箭头所示)，乳酸酚棉蓝染色，×100; E，分生孢子头，双层小梗(箭头所示)，乳酸酚棉蓝染色，×1 000；F，分生孢子头，生理盐水镜检，×1 000，箭头所示为粗糙有刺的分生孢子梗茎。

图5 黄曲霉

注：A，PDA，28 ℃ 4 d；B，中国蓝平板，28 ℃ 4 d；C，血平板，28 ℃ 4 d；D，分生孢子头，双层小梗(箭头所示)，乳酸酚棉蓝染色，×400；E，曲霉头，生理盐水镜检，×1 000；F，分生孢子，乳酸酚棉蓝染色，×1 000。

图6 黑曲霉

注：A，PDA，28 ℃ 7 d；B，SDA，28 ℃ 7 d；C，SDA，28 ℃ 4 d，可见可溶性红色色素；D、E，分生孢子头，双层小梗(箭头所示)，乳酸酸酚棉蓝染色，×400；F，粉孢子，乳酸酚棉蓝染色，×1 000。

图7 土曲霉

注：A，PDA，28 ℃ 7 d; B，菌核，PDA，28 ℃ 21 d；C，闭囊壳，乳酸酚棉蓝染色，×1 000；D，分生孢子头，双层小梗(箭头所示)，乳酸酚棉蓝染色，×400；E，壳细胞，乳酸酚棉蓝染色，×1 000；F，分生孢子头，乳酸酚棉蓝染色，×400。

图8 构巢曲霉

注：A, PDA,28 ℃ 7 d; B, SDA,28 ℃ 7 d; C, 察氏培养基，28 ℃ 7 d; D, PDA,28 ℃ 7 d, 镜下形态，未染色，×100；E，分生孢子头，未染色, ×1 000；F，分生孢子头，乳酸酚棉蓝染色，×1 000。

图9 棒曲霉

注：A, SDA, 28 ℃ 7 d; B, PDA,28 ℃ 7 d; C, 察氏培养基,28 ℃ 7 d; D, 分生孢子头，双层小梗(箭头所示)，乳酸酚棉蓝染色，×400; E, 分生孢子头，乳酸酚棉蓝染色，×400；F, 壳细胞，未染色，×1 000。

图10 焦曲霉

注：A, PDA, 28 ℃ 10 d; B, SDA, 28 ℃ 10 d; C, PDA, 28 ℃ 14 d; D,分生孢子头, 双层小梗(箭头所示), 乳酸酚棉蓝染色，×1 000; E、F, 分生孢子头，青霉样不完整顶囊，乳酸酚棉蓝染色，×400。

图11 聚多曲霉

注：A、B, PDA, 28 ℃ 10 d; C, SDA, 28 ℃ 10 d; D, 分生孢子头，双层小梗(箭头所示)，乳酸酚棉蓝染色，×1 000; E、F，分生孢子头，青霉样不完整顶囊，乳酸酚棉蓝染色，×1 000。

图12 杂色曲霉

注：A, 200 g/L葡萄糖的PDA,28 ℃ 7 d; B, 200 g/L葡萄糖的SDA,28 ℃ 14 d; C, 20 g/L葡萄糖的SDA,28 ℃ 7 d; D、E, 200 g/L葡萄糖的PDA, 分生孢子头，乳酸酚棉蓝染色，×400；F, 20 g/L葡萄糖的PDA,28 ℃ 7 d,分生孢子头,乳酸酚棉蓝染色，×400。

图13 局限曲霉

5 形态学鉴定应注意的问题

曲霉培养最好使用察氏培养基和PDA培养使其呈现其标准菌落形态，而在沙氏培养基、血平板、巧克力平板等分离培养基上，曲霉生长速度、菌落颜色、产孢速度等方面有比较大偏差，会误导鉴定方向。菌落大小、正反面颜色、纹理、色素、是否分泌液滴对曲霉鉴定有指导意义。但多次传代培养会引起菌落变异，菌落颜色消失逐渐变成白色，液滴和色素消失，影响菌种辨别。镜下主要从分生孢子头形态来辨别，但部分菌株由于药物和宿主因素可导致变异而产孢缺乏，可以通过更换培养基(察氏培养基)、改变光照(如紫外照射)，提高培养温度(45 ℃或48 ℃ )、切开培养基阻断营养供给等方式促进产孢，若仍然不产孢，需通过分子生物学方法鉴定[19]。未来可能还将运用曲霉的蛋白质组、代谢组、气味等来鉴定。

临床分离培养出曲霉后，一定要与患者临床症状、影像学、曲霉相关的血清学检查(GM试验、曲霉抗原等)相结合，尤其是来源于开放部位分离的曲霉，应排除污染或定植。

致谢：本文部分图片得到陈东科、陈会、占萍、钱雪琴、冯长海、王冲等同仁帮助，谨表谢意！

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2017-08-01)

(本文编辑：刘群)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.10.09

徐和平，1972年生，男，副主任技师，从事微生物检验工作。

黄江山，主任技师，E-mail:13600918159@163.com。

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