葛根素皮下注射对妊娠期低蛋白饮食孕鼠所产仔鼠体质量及骨质代谢的影响

王丹虹，齐华雪，罗开菊，陈平洋

(1海口市人民医院， 海口570208；2中南大学湘雅二医院)

葛根素皮下注射对妊娠期低蛋白饮食孕鼠所产仔鼠体质量及骨质代谢的影响

王丹虹1，齐华雪2，罗开菊2，陈平洋2

(1海口市人民医院， 海口570208；2中南大学湘雅二医院)

目的探讨葛根素皮下注射对妊娠期低蛋白饮食孕鼠所产仔鼠生长发育及骨质代谢的影响及其机制。方法将18只怀孕SD大鼠随机分为正常蛋白饲料喂养6只、低蛋白饲料喂养12只。正常蛋白饲料喂养大鼠在孕期、哺乳期均给予21%正常蛋白饲料喂养，将其分娩的仔鼠作为正常组。低蛋白饲料喂养大鼠在孕期给予10%低蛋白饲料喂养至分娩，哺乳期改为21%正常蛋白饲料喂养，将其分娩的仔鼠随机分为模型组、葛根素组。葛根素组自出生1周开始，腹部皮下注射葛根素注射液50 mg/(kg·d)；正常组、模型组腹部皮下注射等体积灭菌用水；三组均连续干预2周。比较各组出生时宫内发育迟缓(IUGR)发生率，出生时及出生1、3、8周时体质量及血清胰岛素样生长因子1(IGF- 1)、骨保护素(OPG)、骨钙素(BGP)、骨碱性磷酸酶(BALP)水平。结果模型组出生时及出生1、3、8周时体质量均低于正常组(P均<0.05)；葛根素组出生时及出生1周时体质量均低于正常组(P均<0.05)，出生3、8周时体质量与正常组比较P均<0.05，出生3、8周时体质量均高于模型组(P均<0.05)。模型组、葛根素组出生时IUGR发生率均高于对照组(P均<0.05)。出生1周时，正常组血清IGF- 1、OPG、BGP、BALP水平均高于模型组及葛根素组(P均<0.05)。出生3周时，正常组血清IGF- 1、BGP、BALP水平均低于模型组及葛根素组；葛根素组血清IGF- 1、BALP水平均高于模型组；组间比较P均<0.05。出生8周时，葛根素组血清BGP高于模型组(P<0.01)，BALP低于模型组(P<0.05)。结论葛根素皮下注射可促进妊娠期低蛋白饮食孕鼠所产仔鼠生长发育；其机制可能与促进骨质代谢有关。

宫内发育迟缓；低蛋白饮食；葛根素；胰岛素样生长因子1；骨保护素；骨钙素；骨碱性磷酸酶；大鼠

流行病学调查发现，孕期营养不良不仅会导致胎儿宫内发育迟缓(IUGR)[1]，还可能导致成年期代谢紊乱，甚至影响骨质代谢，但其确切机制尚不明确[2]。研究发现，葛根的提取物葛根素能够改善去卵巢大鼠及绝经后妇女的骨质疏松状况，促进骨折愈合[3,4]。2015年1月～2016年7月，我们观察了葛根素皮下注射对妊娠期低蛋白饮食孕鼠所产仔鼠生长发育及骨质代谢的影响，现分析结果并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 材料 健康3月龄SD大鼠，雌性18只、雄性9只，体质量220～260 g，由湖南省人民医院实验动物中心提供。葛根素注射液，购自天津药业集团新郑股份有限公司，批号：1103251，规格：50 mg：2 mL/支。胰岛素样生长因子1(IGF- 1)、骨保护素(OPG)、骨钙素(BGP)、骨碱性磷酸酶(BALP)试剂盒均购自武汉优尔生科技股份有限公司。

1.2 大鼠分组处理 所有大鼠分笼适应性喂养1周，按照雌雄2∶1的比例置于同一笼中交配，按照文献[5]方法判定是否受孕。根据受孕时间将孕鼠编号，采用随机数字表法将18只孕鼠分为正常蛋白饲料喂养6只、低蛋白饲料喂养12只。正常蛋白饲料喂养雌鼠在孕期、哺乳期均给予21%正常蛋白饲料喂养。低蛋白饲料喂养雌鼠孕期给予10%低蛋白饲料喂养至分娩，哺乳期改为21%正常蛋白饲料喂养[5,6]。孕鼠阴道涂片确定受孕后20～22天分娩，两组均产仔，未发生流产现象。18只雌性大鼠中有16只成功受孕，其中正常蛋白饲料喂养6只、低蛋白饲料喂养10只。低蛋白饲料喂养大鼠中1只出现“食幼”现象，剔除实验。将正常蛋白饲料喂养大鼠分娩的仔鼠作为正常组(69只)，将低蛋白饲料喂养大鼠分娩的仔鼠随机分为模型组(41只)、葛根素组(58只)。三组出生24 h内分别死亡3、2、3只，组间比较P>0.05。葛根素组自出生1周开始，每日腹部皮下注射葛根素注射液50 mg/(kg·d)；正常组、模型组腹部皮下注射等体积灭菌用水。三组均连续干预2周。

1.3 相关指标观察 ①体质量：使用Kemdy KD. F电子天平，按照文献[5]方法每日测量仔鼠体质量，统计仔鼠出生时及出生1、3、8周时体质量及出生时IUGR发生率。②血清IGF- 1、OPG、BGP、BALP水平：各组分别于出生1、3、8周时经心脏采血，离心后留取上清液，置于-70 ℃冰箱保存。采用ELISA法检测血清IGF- 1、OPG、BGP、BALP。

2 结果

2.1 三组体质量及IUGR发生率比较 模型组出生时及出生1、3、8周时体质量均低于正常组(P均<0.05)；葛根素组出生时及出生1周时体质量均低于正常组(P均<0.05)，出生3、8周时体质量与正常组比较P均>0.05，出生3、8周时体质量均高于模型组(P均<0.05)，见表1。正常组、模型组、葛根素组出生时发生IUGR分别有1、32、49只，IUGR发生率分别为1.45%、78.05%、84.48%。模型组、葛根素组IUGR发生率均高于对照组(P均<0.05)。

表1 三组体质量比较

注：与正常组同时间点比较，*P<0.05；与模型组同时间比较，△P<0.05。

2.2 三组血清IGF- 1、OPG、BGP、BALP水平比较 出生1周时，正常组血清IGF- 1、OPG、BGP、BALP水平均高于模型组及葛根素组(P均<0.05)。出生3周时，正常组血清IGF- 1、BGP、BALP水平均低于模型组及葛根素组；葛根素组血清IGF- 1、BALP水平均高于模型组；组间比较P均<0.05。出生8周时，葛根素组血清BGP高于模型组(P<0.01)，BALP低于模型组(P<0.05)。其余各组间各时间点比较P均>0.05。见表2。

表2 三组血清IGF- 1、OPG、BGP、BALP水平比较

注：与同组出生1周比较，*P<0.05；与同组出生3周比较，#P<0.05；与正常组同时间点比较，△P<0.05；与模型组同时间点比较，▽P<0.05。

3 讨论

胎儿各组织、器官的正常生长发育依赖于母体蛋白质、脂类、碳水化合物等营养物质的适量摄入，母体孕期各类营养物质的摄入及其营养状况直接影响胎儿的生长发育。若在孕期母体因蛋白质摄入不足，会导致胎儿IUGR，甚至生长发育受阻，直接影响胎儿的分娩和智力发育。另有研究证实，IUGR与成年期心脏病、脑卒中、糖尿病等疾病的发生关系密切[2]。IUGR的致病因素较多，目前比较明确的有妊娠期营养不良、胎儿宫内感染、多胎妊娠、妊娠期不良生活习惯、接触有毒物质或射线、环境污染等[2,6]，其中以妊娠期营养不良最为常见，尤其是蛋白质和热量摄入不足所致IUGR约占IUGR发病率的50%。本研究结果显示，模型组、葛根素组出生时体质量均低于正常组，两组IUGR发生率均高于对照组，提示低蛋白饮食是导致IUGR发生的重要原因。

葛根素为葛根的主要活性成分之一，属于异黄酮类化合物，化学名为8- β- D- 葡萄吡喃糖- 4,7- 二羟基异黄酮，分子式为C21H20O9。现代药理学研究表明，葛根素的主要药理作用有扩张冠状动脉、抗心肌缺血、降低心肌耗氧量、降血糖、调节血脂、改善微循环、防止骨吸收及促进骨骼生长，对脑缺血及缺血再灌注引起的神经细胞损伤亦具有保护作用等[7]。临床研究发现，葛根素能改善成年人及老年人骨代谢及绝经妇女、老年人骨质疏松，可促进骨折恢复；促进成骨细胞作用、抑制破骨细胞作用是其主要作用机制[8,9]。基础研究显示，葛根素可促进成骨细胞增殖、分化，抑制破骨细胞作用，通过增加骨形成、减少骨吸收而避免骨量丢失，改善骨密度，可用于防治成年期骨质疏松症[10]。

IGF- 1是一类广谱促生长因子，与胰岛素结构类似，具有促进有丝分裂，刺激细胞生长、增殖及分化等功能，主要影响合成代谢，可提高葡萄糖和氨基酸的摄取率；亦是骨骼中含量最丰富的生长因子[11]，能介导内分泌因子调节骨骼生长，刺激骨胶原合成与基质矿化，促进软骨成熟、骨形成及分化。OPG是由成骨细胞合成并分泌的，具有抑制破骨细胞分化成熟的作用，其水平变化先于骨密度，可较早反映骨代谢状况。有研究认为，老年骨质疏松症患者血清OPG水平升高可在一定程度上抑制骨量丢失，维持骨量[12]。BGP是骨骼中含量最丰富的胶原蛋白，在骨形成时由成骨细胞合成与分泌的，大部分BGP参与骨基质构建，仅有一小部分被释放入血液循环。在骨吸收过程中骨基质被破坏，参与构建的BGP释放入血，故外周血BGP水平能够反映骨转化情况，是评估骨形成异常的敏感指标[13]。BALP亦是由成骨细胞合成与分泌的，是骨形成的特异性标志物，可间接反映成骨细胞活性。血清BALP水平变化可准确反映骨改变的早期情况，是评价骨形成与骨转换的标志物之一[14]。

有研究提示，婴幼儿期低骨密度可能与妊娠期营养不良相关，可增加其成年期罹患骨质疏松症的风险，但其发生机制尚不清楚[8]。本研究结果显示，出生1周时，正常组血清IGF- 1、OPG、BGP、BALP水平均高于模型组及葛根素组，提示孕期低蛋白饮食导致骨代谢水平降低。出生3周时，模型组及葛根素组血清IGF- 1、BGP、BALP水平均高于正常组，提示孕期低蛋白饮食孕鼠所产仔鼠在上述指标方面存在追赶生长现象。出生3周时，葛根素组血清IGF- 1、BALP水平均高于模型组，提示骨形成增加，说明葛根素在追赶生长现象中可能具有较好的促进作用。追赶生长亦叫补偿性生长，用于描述因病理因素导致生长迟缓的儿童在去除这些病理因素后出现的生长加速现象。追赶生长不足会导致儿童身材矮小及认知功能发育落后，但过度追赶生长可能会导致成年期肥胖、高血压、心脑血管疾病、胰岛素抵抗及糖尿病、内分泌紊乱及脂代谢异常等不良结局。有研究报道，早产儿早期过高的骨转化率可能是导致其成年期代谢性骨病的发病机制之一[15]，早产儿及小于胎龄儿其追赶生长趋势与体内IGF- 1水平变化一致[16]。本研究结果显示，出生8周葛根素组血清BGP水平高于模型组，血清BALP水平低于模型组，其余各组间比较差异均无统计学意义。提示模型组出生8周时仍在以较高的骨转化率追赶生长，而经葛根素干预后的仔鼠骨转化率较前降低，推测葛根素能在维持其适度追赶生长的同时改善其成年期骨骼的发育状态。

综上所述，葛根素皮下注射可促进妊娠期低蛋白饮食孕鼠所产仔鼠生长发育，其机制可能是通过调节血清IGF- 1、OPG、BGP、BALP水平，改善骨代谢状态，继而使其保持适宜的追赶生长。

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陈平洋(E- mail: wycpyfu@163.com)

10.3969/j.issn.1002- 266X.2017.36.014

R714.43

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1002- 266X(2017)36- 0046- 03

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