β- 榄香烯对VEGF诱导的人脐静脉内皮细胞迁移的影响及机制

贺惠娟，邢彩珍，熊振芳

(湖北中医药大学，武汉430065)

·基础研究·

β- 榄香烯对VEGF诱导的人脐静脉内皮细胞迁移的影响及机制

贺惠娟，邢彩珍，熊振芳

(湖北中医药大学，武汉430065)

目的探讨β- 榄香烯对血管内皮生长因子(VEGF)诱导的人脐静脉内皮细胞迁移的影响及其作用机制。方法人脐静脉内皮细胞EA.hy926体外传代培养，随机分为对照组、VEGF组、VEGF+榄香烯组。对照组仅予无血清的DMEM培养基处理；VEGF组在对照组基础上予适量VEGF，使其终浓度为10 ng/mL；VEGF+榄香烯组在VEGF组基础上予适量β- 榄香烯，使其终浓度为100 μg/mL。各组处理24 h，收集细胞，采用Transwell小室法检测细胞迁移能力，Real- time PCR法检测细胞转录因子ETS1及迁移相关分子CDC42、RAC1、RAC2 mRNA表达，JASPAR数据库分析迁移相关分子CDC42、RAC1、RAC2启动子序列中可能的转录因子ETS1结合位点。结果对照组、VEGF组、VEGF+榄香烯组细胞迁移数分别为(9.4±3.7)、(50.4±13.9)、(23.7±8.4)个；与对照组比较，VEGF组细胞迁移能力明显增强(P<0.05)；与VEGF组比较，VEGF+榄香烯组细胞迁移能力明显降低(P<0.05)。与对照组比较，VEGF组细胞转录因子ETS1及迁移相关分子CDC42、RAC1、RAC2 mRNA相对表达量均明显升高(P均<0.05)；与VEGF组比较，VEGF+榄香烯组细胞转录因子ETS1及迁移相关分子CDC42、RAC1、RAC2 mRNA相对表达量均明显降低(P均<0.05)。在迁移相关分子CDC42、RAC1、RAC2启动子序列中分别发现1、2、7个转录因子ETS1结合位点。结论β- 榄香烯可抑制VEGF诱导的人脐静脉内皮细胞迁移，其机制可能与抑制转录因子ETS1表达，调控RhoGTP酶家族迁移相关分子CDC42、RAC1和RAC2的转录表达有关。

β- 榄香烯；人脐静脉内皮细胞；细胞迁移；血管内皮生长因子；转录因子；RhoGTP酶家族迁移相关分子

血管新生对恶性实体肿瘤的生长和转移具有极其重要的作用[1]，而血管内皮细胞迁移是血管新生的重要环节[2]。因此，阻止血管内皮细胞迁移有可能抑制恶性实体肿瘤的生长和转移。β- 榄香烯是从姜科姜黄属多种植物中提取的中药单体物质，已被国家药监局批准用于多种恶性实体肿瘤和癌性胸腹水的治疗，并取得了较好的疗效[3]，其主要作用机制是阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡[4,5]。但其对血管内皮细胞迁移的影响及机制尚不完全明了。2016年1～5月，本研究观察了β- 榄香烯对血管内皮生长因子(VEGF)诱导的人脐静脉内皮细胞迁移的影响，同时检测细胞转录因子ETS1和迁移相关分子CDC42、RAC1、RAC2 mRNA表达，分析RhoGTP酶家族迁移相关分子序列中可能的转录因子ETS1结合位点，旨在探讨β- 榄香烯对人脐静脉内皮细胞迁移的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人脐静脉内皮细胞EA.hy926购自中国科学院上海细胞库。β- 榄香烯和VEGF购自美国Sigma公司。所有引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。ABI 7500型实时荧光定量PCR系统购自美国Life Tech公司，奥林巴斯IX51显微镜购自日本Olympus株式公社。DMEM、FBS、胰酶和TRIzol购自美国Gibco公司。逆转录试剂盒和SYBR荧光定量试剂购自北京天根生化科技有限公司。Transwell板和Transwell小室购自美国Corning公司。

1.2 细胞分组处理 人脐静脉内皮细胞EA.hy926传代培养，随机分为对照组、VEGF组和VEGF+榄香烯组。对照组仅予无血清的DMEM培养基处理24 h。VEGF组在对照组基础上予适量VEGF，使其终浓度为10 ng/mL，处理24 h；VEGF+榄香烯组在VEGF组基础上予适量β- 榄香烯，使其终浓度为100 μg/mL，处理24 h。

1.3 相关指标观察

1.3.1 细胞迁移能力 采用Transwell小室法。收集各组处理24 h细胞，制成密度为2.5×105个/mL的细胞悬液备用。取细胞悬液200 μL加入Transwell小室上室，下室加入各组相应的培养基。培养12 h，取出小室，弃去孔中培养基，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，然后加入0.1%结晶紫染色。倒置显微镜下，随机选择5个400倍视野，计数迁移细胞数。

1.3.2 转录因子ETS1及迁移相关分子CDC42、RAC1、RAC2 mRNA表达 采用Real- time PCR法。收集各组处理24 h细胞，TRIzol法提取细胞总RNA，按逆转录试剂盒说明将总RNA逆转为cDNA，然后进行PCR扩增。引物序列：ETS1上游引物：5′-GAGTCAACCCAGCCTATCCA- 3′，下游引物：5′- GAG- CGTCTGATAGGACTCTG- 3′；CDC42上游引物：5′- G- ACAGATTACGACCGCTGAG- 3′，下游引物：5′- GGA- GTCTTTGGACAGTGGTG- 3′；RAC1上游引物：5′- CG- GTGAATCTGGGCTTATGG- 3′，下游引物：5′- GAGGT- TATATCCTTACCGTAC- 3′；RAC2上游引物：5′- CAG- CCAATGTGATGGTGGAC- 3′，下游引物：5′- GAGAAG-CAGATGAGGAAGAC- 3′；β- actin上游引物：5′- CAC- CATTGGCAATGAGCGGT- 3′，下游引物：5′- AGGTCT- TTGCGGATGTCCAC- 3′。具体步骤按试剂盒说明书进行。以β- actin为内参，采用2-ΔΔCt法计算目的mRNA相对表达量。

1.3.3 细胞迁移相关分子启动子区域转录因子ETS1结合位点分析 通过NCBI数据库查询迁移相关分子CDC42、RAC1和RAC2启动子序列，并利用JASPAR数据库分析各启动子序列中可能的ETS1结合位点。

2 结果

2.1 各组细胞迁移能力比较 对照组、VEGF组、VEGF+榄香烯组细胞迁移数分别为(9.4±3.7)、(50.4±13.9)、(23.7±8.4)个。与对照组比较，VEGF组细胞迁移数明显增多(P<0.05)；与VEGF组比较，VEGF+榄香烯组细胞迁移数明显减少(P<0.05)。

2.2 各组细胞转录因子ETS1和迁移相关分子CDC42、RAC1、RAC2 mRNA表达比较 见表1。

表1 各组细胞转录因子ETS1和迁移相关分子CDC42、 RAC1、RAC2 mRNA相对表量达比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与VEGF组比较，#P<0.05。

2.3 细胞迁移相关分子启动子区域转录因子ETS1结合位点分析 细胞迁移相关分子CDC42、RAC1和RAC2启动子序列中分别发现1、2、7个转录因子ETS1结合位点。见表2。

表2 细胞迁移相关分子CDC42、RAC1和RAC2启动 子区域ETS1结合序列和位点分布

3 讨论

中医病机认为，瘀血阻滞是肿瘤的主要病因病机之一。中药莪术能破血消积、行气止痛，临床广泛用于治疗肿瘤、慢性肝病等。β- 榄香烯是从中药莪术中提取的一种倍半萜衍生物。我们前期研究发现，β- 榄香烯可上调Rho信号通路中的GDIβ表达，下调VGEF表达，从而抑制肝内微血管生成。同时有学者发现，β- 榄香烯能够降低肿瘤细胞VEGF表达，抑制肿瘤血管新生。血管内皮细胞迁移是血管新生过程中的一个重要环节，β- 榄香烯是否通过影响血管内皮细胞迁移发挥抑制肿瘤血管新生的作用及其机制尚不明确。本研究我们利用VEGF刺激人脐静脉内皮细胞迁移，发现转录因子ETS1以及RhoGTP酶家族迁移相关分子CDC42、RAC1、RAC2 mRNA表达均明显升高；而β- 榄香烯干预能够抑制VEGF诱导的EA.hy926细胞迁移，同时VEGF+榄香烯组转录因子ETS1和RhoGTP酶家族迁移相关分子CDC42、RAC1、RAC2 mRNA表达较VEGF组明显降低。表明β- 榄香烯抑制VEGF诱导的EA.hy926细胞迁移效果是明确的。

VEGF作为一种主要的促血管生成因子，在肿瘤血管生成过程中具有重要作用[6～8]。VEGF能诱导血管内皮细胞向肿瘤组织方向迁移，也可作用于内皮细胞使转录因子ETS1表达升高，继而促进内皮细胞迁移[9～12]。VEGF通过与其受体结合，引起受体自身磷酸化后，激活细胞内信号途径介导的内皮细胞迁移，其中研究较为深入的是RhoGTP酶家族。RhoGTP酶家族在肿瘤细胞和内皮细胞中均有表达，其介导的血管内皮细胞迁移主要通过肌钙蛋白的调节来实现，其家族主要成员包括CDC42、RAC1和RAC2。有研究表明，VEGF能诱导尿激酶型纤溶酶原激活物产生，使血管内皮细胞表达蛋白水解酶、基质金属蛋白酶(MMPs)等，通过降解细胞外基质来促进血管内皮细胞迁移；还能作用于胞质中的转录因子(如ETS1)，影响其相应的靶基因，促进血管内皮细胞迁移[13]。本研究结果亦证实，VEGF刺激后EA.hy926细胞迁移能力增加，并可诱导转录因子ETS1和RhoGTP酶家族迁移相关分子CDC42、RAC1、RAC2 mRNA表达升高。

有研究发现，转录因子ETS1与肿瘤的侵袭和转移有关[14,15]，其表达与VEGF、bFGF、MMPs等肿瘤生长、侵袭和转移相关基因表达呈正相关关系。β- 榄香烯可抑制转录因子ETS1表达，从而影响下游靶基因的转录表达，继而影响肿瘤血管生成。RhoGTP酶家族中CDC42活化导致细胞丝状伪足形成，而RAC活化与运动细胞伪足有关。生物信息学分析显示，这些RhoGTP酶家族基因启动子区域均存在转录因子ETS1的结合位点，提示ETS1可能参与调控RhoGTP酶家族基因转录和表达，从而影响血管内皮细胞迁移。本研究结果显示，β- 榄香烯亦能抑制RhoGTP酶家族迁移相关分子CDC42、RAC1、RAC2的表达。

综上所述，β- 榄香烯可抑制转录因子ETS1表达，降低含ETS1结合位点的RhoGTP酶家族迁移相关分子CDC42、RAC1和RAC2启动子区域活性及其转录表达，导致细胞丝状伪足和运动伪足形成异常，继而抑制血管内皮细胞迁移。ETS1可能是β- 榄香烯干预肿瘤血管新生的一个新靶点。

[1] Weis SM, Cheresh DA. Tumor angiogenesis: molecular pathways and therapeutic targets[J]. Nat Med, 2011,17(11):1359- 1370.

[2] Risau W. Mechanisms of angiogenesis[J]. Nature, 1997,386(6626):671- 674.

[3] Xu HB, Zheng LP, Li L, et al. Elemene, one ingredient of a Chinese herb, against malignant tumors: a literature- based meta- analysis[J]. Cancer Invest, 2013,31(2):156- 166.

[4] 王小晓，瞿延晖.β- 榄香烯对人胃癌BAC823细胞凋亡及P38MAPK磷酸化的影响[J].时珍国医国药，2010，21(8):1865- 1867.

[5] 殷玉琨，宋爱莉，孙子渊.榄香烯乳对乳腺癌细胞株MDA- MB- 231及MCF- 7凋亡的影响[J].山东医药，2013，53(16):7- 9.

[6] 臧文华，唐德才，尹刚，等.黄芪莪术配伍对人肝癌裸鼠原位移植瘤新生血管生成的影响[J].时珍国医国药，2014，25(3):516- 518.

[7] Lv XZ, Zheng MY, Lin ZQ, et al. Granzyme B- truncated VEGF fusion protein represses angiogenesis and tumor growth of OSCC[J]. Oral Dis, 2016,22(7):688- 696.

[8] 李文，李长生.VEGF- Notch信号通路与血管再生的关系[J].山东医药，2014，54(13):83- 85.

[9] Sahin A, Vercamer C, Kaminski A, et al. Dominant- negative inhibition of Ets 1 suppresses tumor growth, invasion and migration in rat C6 glioma cells and reveals differentially expressed Ets 1 target genes[J]. Int J Oncol, 2009,34(2):377- 389.

[10] Lamalice L, Le Boeuf F, Huot J. Endothelial cell migration during angiogenesis[J]. Circ Res, 2007,100(6):782- 794.

[11] Wagner SC, Ichim TE, Ma H, et al. Cancer anti- angiogenesis vaccines: is the tumor vasculature antigenically unique[J]. J Transl Med, 2015(13):340.

[12] Wang G, Li X, Huang F, et al. Antitumor effect of beta- elemene in non- small- cell lung cancer cells is mediated via induction of cell cycle arrest and apoptotic cell death[J]. Cell Mol Life Sci, 2005,62(7- 8):881- 893.

[13] Prager GW, Breuss JM, Stefan S, et al. Vascular endothelial growth factor (VEGF) induces rapid prourokinase (pro- uPA) activation on the surface of endothelial cells[J]. Blood, 2004,103(3):955- 962.

[14] Li AX, Xin WQ, Ma CG. Fentanyl inhibits the invasion and migration of colorectal cancer cells via inhibiting the negative regulation of Ets- 1 on BANCR[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2015,465(3):594- 600.

[15] 刘春丽，张圣林，黄跃雁，等.基质金属蛋白酶- 1、转录调节因子Ets- 1与肿瘤关系的研究进展[J].山东医药，2011，51(40):115- 116.

湖北省自然科学基金资助项目(2015CB591)。

熊振芳(E- mail: xiong_zhenfang@126.com)

10.3969/j.issn.1002- 266X.2017.36.008

R94

A

1002- 266X(2017)36- 0028- 03

2016- 07- 22)

声 明

近年来，一些不法分子假冒《山东医药》中介、代理甚至编辑的名义发布稿约，承诺发稿，并高额收取相关费用，已致部分作者受骗。在此，我刊郑重声明，《山东医药》无任何中介、代理机构或个人，务请作者提高警惕。需向《山东医药》杂志投稿者，请查阅《山东医药》杂志上标明的电子邮箱及投稿须知，严防被骗。同时，正告不法分子停止非法行为，否则将负法律责任。

本刊编辑部