骨髓增生异常综合征剪接体突变的研究进展
2017-11-14黄林娜刘鹏琴综述代国知审校
黄林娜 刘鹏琴 综述 代国知 审校
骨髓增生异常综合征剪接体突变的研究进展
黄林娜 刘鹏琴 综述 代国知 审校
研究发现剪接体突变在骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome，MDS）疾病的发生发展中发挥重要作用，其突变基因包括SF3B1、U2AF1（U2AF35）、SRSF2、ZRSR2、PRPF40B、SF1、SF3A1和U2AF2等，突变基因（45%～85%）发生在mRNA剪接过程中的3'剪接位点，主要表现为杂合性错义突变。了解RNA剪接对MDS的靶向治疗及预后具有指导作用。本文就剪接体相关突变基因在MDS中的致病机制、靶向治疗及临床预后等进行综述。
骨髓增生异常综合征 剪接体 基因突变 靶向治疗
骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndromes，MDS）是一组起源于造血干/祖细胞的高度异质性的血液系统肿瘤，中国由于人口老龄化加剧，其发病率呈明显上升趋势。MDS呈现出高度的异质性，致病机制至今尚未明确，总体预后较差。有研究发现获得性体细胞突变与MDS疾病发展密切相关。除了获得性体细胞突变外，RNA剪接机制、DNA甲基化、染色质修饰等基因机制的失调在MDS致病机理中越来越受到重视。Papaemmanuil等［1］和Haferlach等［2］分别从738位及944位MDS及相关肿瘤患者中测得111和104个突变基因，78%以上的患者至少有1个致瘤性的基因突变。RNA剪接突变在MDS中是最常见的突变方式，常发生在疾病的早期，对疾病的临床特征起着决定性作用，也影响随后基因组的演化。部分剪接突变因子作为分子生物标记已用于MDS疾病的诊断、分层及预后转归等评估［3］。近年来，逐渐建立了MDS相关的靶向治疗，如DNA甲基转移酶抑制剂（如地西他滨）在高危MDS患者中运用。虽然剪接调节体的靶向治疗已经进行了临床前实验，但暂无确切可行的靶向药物运用到临床。本文对剪接体相关突变基因在MDS中的致病机制、靶向治疗及临床预后等问题进行综述。
1 RNA剪接在MDS疾病发生、发展中的作用及机制
剪接体是一个超大分子复合物，DNA转录完成后形成前-mRNA（pre-mRNA），通过剪接体切除内含子，并将外显子按照一定的顺序进行拼接，从而形成成熟的mRNA。剪接体主要有5种核小RNA（sn-RNA）即U1、U、U4、U5、U6组成。与特异蛋白质发生相互作用形成的复合物被称为核小核糖核蛋白颗粒（small nuclear ribonucleoprotein particle，snRNP），共同完成mRNA前体中内含子的剪接。RNA剪接体的作用主要是识别内含子和外显子的交界部位以及催化内含子的切除及与外显子的拼接［4］。剪接体基因突变常是异基因突变，突变位于氨基酸残基的位置并常伴其他基因的突变，诱导重要蛋白的丢失、异常功能的表达和细胞凋亡的启动，最终导致包括MDS在内的极高恶性事件发生［5］。有研究发现RNA剪接因子突变包括 SF3B1、U2AF1（U2AF35）、SRSF2、ZRSR2、PRPF40B、SF1、SF3A1和U2AF2，其中最常见的突变因子为SF3B1、SRSF2、U2AF1和ZRSR2［6］。
1.1 SF3B1
SF3B1即剪接因子3B复合物的第一亚单位，定位于染色体2号染色体长臂（2q33.1）上，含有25个外显子，蛋白质分子量155 kDa。SF3B1的突变集中在第12～16外显子中，即翻译后的4、5、6结构域内，主要突变类型为K700E（700位上的赖氨酸被谷氨酸所代替）占55%［7］。SF3B1突变率在MDS中约占28.1%，而在 MDS-RS（MDS with ring sideroblasts，MDS-RS）中SF3B1突变率高达97.7%［8］，Cazzola等［9］发现大量的异常剪接事件与SF3B1突变密切相关，常由3'剪接位点的错误识别引起，50%的3'剪接位点改变导致一个框移突变。SF3B1突变可对其下游基因造成影响，特别是亚铁血红素合成的相关基因，并降低细胞周期分化以及DNA修复等相关基因的表达。MDS-RS型中环形铁粒幼细胞的特点是过多的铁沉积在线粒体内，且骨髓环形铁粒幼细胞百分率的增高常伴随ABCB7表达水平的下调［12］。Mupo等［10］通过研究发现，SF3B1突变的MDS环形铁粒幼红细胞的形成是由于血红素合成过程中关键基因的异常剪接引起，同时伴多个蛋白水平的下调，其中包括线粒体铁运输蛋白ABCB7。综合多项研究可以发现SF3B1突变导致铁转运体ABCB7下调，随后铁沉积在红细胞线粒体内从而形成MDS的独特表型MDS-RS［11］。
预后方面，Malcovati等［8］认为MDS-RS伴SF3B1突变常表现出较好的生存率和急性髓细胞白血病（acute myeloid leukemia，AML）转化的低风险性，突变预示着有利的临床结果，将它们纳入分层系统可以改善MDS的风险评估。Thol等［13］研究却认为SF3B1不是一个独立的预后因素，其预后良好可能与MDSRS这一型分化良好的特点相关。但在世界卫生组织（WHO）2016年骨髓肿瘤分类（修订版）中提出SF3B1突变常出现在MDS-RS的早期事件中，体现一种独特的基因表达谱，并与良好预后相关［3］。
1.2 SRSF2
SRSF2即富含丝氨酸（S）和精氨酸（R）蛋白的剪接因子2，属于SR蛋白家族中的一员，蛋白质分子量为35 kDa。除了剪接作用，SRSF2还参与了DNA稳定性的调节。SRSF2主要的突变位点位于RNA结构域、RS结构域之间的位置第95位氨基酸上，主要突变类型为P95L/R/H［14］。SRSF2是造血细胞存活的必备基因，它的缺乏会导致细胞的凋亡和生长停滞，在SRSF2杂合型血细胞中虽然没有明显异常表型，但是在生长停滞和凋亡的细胞中可发现P95H和Δ8aa突变［15］。Kim等［16］通过研究发现SRSF2 P95H突变在MDS疾病的发展中发挥了重要的作用，SRSF2 P95H突变可以影响SRSF2RNA识别特征序列，增加对CCNG的亲和力而减低GGNG的亲和力。与SRSF2 P95H突变相关的下游靶向基因还包括表观调节因子EZH2，SRSF2突变导致EZH2转录时产生不成熟终止密码子，引起无义介导的mRNA降解和基因下调。Skrdlant等［17］研究发现SRSF2P95-R/L/H突变不会影响蛋白质的细胞定位，因而不会导致激酶2或P53磷酸化，但会增加细胞的早期凋亡并影响细胞分裂周期蛋白25同源蛋白C（cell division cyclin 25 homolog C，Cdc25C）的可变剪接，导致短型CDC25C-C5的增加，而CDC25C-C5的增多与细胞的DNA受损密切相关。
在非RS型的MDS中SRSF2突变率约占11.6%，但在MDS-RS中约占5.5%［6］。在另一项研究中，193例MDS中SRSF2突变率为12.4%，其中80%为错义突变和框移突变，95%的突变在氨基酸P95的位置［13］。Thol等［13］认为MDS伴SRSF2突变的患者常表现出极短的生存率和加速AML的进程。Zhang等［18］研究发现，AML伴SRSF2突变的病例约18.9%来源于骨髓增殖性疾病，分析发现SRSF2突变与差的总体生存率相关。
1.3 U2AF1
U2AF1即U2小核RNA辅助因子1，定位于21号染色体长臂（21q22.3）上，蛋白质分子量为35 kDa。U2AF1突变点相当特别的，涉及到两个高度保守的氨基酸位置（S34或Q157），其C端是锌指结构，侧翼是U2AF的同源基序，常见的突变类型S34F/Y、Q157R/P等［6］。U2AF1突变常导致3'剪接位点的特异序列改变，3'剪接位点S34和Q157的改变会导致相关的临床疾病。伴U2AF1突变的MDS中常出现盒式外显子剪接异常，与野生型相比U2AF1 S34F突变蛋白在3'剪接位点-3的位置对胞嘧啶的识别要高于胸腺嘧啶，而U2AF1 Q157突变在+1位置与鸟嘌呤取代腺苷酸相关［19］。Park等［20］研究发现U2AF1突变在是由于转录过程中增加了末端裂隙和多腺苷酸化位点，导致3'编码区的增加，从而导致mRNA的无效转录和人自噬相关蛋白7（autophagy-related protein 7，ATG7）水平的降低，从而降低自噬，同时促进转录，常伴随线粒体功能紊乱并增加活性氧的产生，导致基因组的不稳定性并提高自发性突变的频率。
MDS中U2AF1的突变率为7.3%（14/193），常伴随ASXL1及DNMT3A突变［13］。在非RS型的MDS中U2AF1 的突变率为 12%［6］。Wu等［21］在研究 305位MDS患者中发现U2AF1突变率为8.6%，且U2AF1突变常伴随+8或20q-等染色体改变。在预后方面，伴U2AF1突变的患者意味着更短的生存率和极易向AML转化的高风险性［21］。Thol等［13］也通过研究发现U2AF1突变的患者预后总体生存率与未突变患者无明显区别，但易向白血病转化。
1.4 ZRSR2
ZRSR2即锌指结构（CCCH型），RNA结合基序和富含丝氨酸/精氨酸的2基因位于Xp22.1上，所编码的蛋白与U2AF异二聚体相关，是识别前体mRNA剪接体功能性3'剪接位点所必需的，在MDS中ZRSR2的突变发生在整个转录的过程，与SF3B1、SRSF2和U2AF1等突变的热点形成对比。位于X染色体的剪接体ZRSR2的突变与MDS疾病的发生发展相关，其致病机理至今尚未完全明确。Madan等［22］研究发现ZRSR2突变与U12型内含子的错误剪接相关，ZRSR2的敲除会导致MDS骨髓的U12型内含子的剪接功能和RNA序列受损，ZRSR2活性的缺失会增加剪接的错误率，如12型内含子的保留，在体外实验中ZRSR2缺乏的细胞表现出增殖潜力的减低及红系分化的异常。在MDS中U12型内含子对剪接体的调节是ZRSR2突变的特征。ZRSR2基因的剪接位点突变和框移突变常发生于男性患者。
ZRSR2的突变率在血液系统恶性肿瘤中较低，在MDS和CMML患者中不超过8%［6］。ZRSR2突变的类型包括移码突变，无义突变和错义突变，该突变在MDS中约占3%～11%，伴随中性粒细胞的减少［6］。在预后方面，Damm等［23］发现ZRSR2突变在MDS中更集中于IPSS的中危1型和2型，骨髓原始细胞比例较高，在不合并TET2突变的情况下具有更短的生存率和更高的AML转化率。而Thol等［13］的研究则指出ZRSR2突变与IPSS分型无关，且对预后无明显影响。
2 RNA剪接突变的靶向治疗
MDS传统的治疗药物局限在去甲基化治疗剂如阿扎胞苷和地西他滨，免疫调解剂来那度胺和造血生长因子。行异基因造血干细胞移植的患者不到5%，主要原因是患者年龄较大而无法耐受移植后的不良反应，因此生存率也不到5%。MDS和相关的髓系肿瘤中，剪接体正成为一种新的靶向治疗目标。在美国关于剪接调解体的临床试验于2016年开始实行［24］。
在人类肿瘤剪接体突变的研究中发现自然界的细菌发酵产物具有抗肿瘤特性。光亲和性标记技术通过与3′剪接位点紧密连接证实了这些产物的功能，细菌发酵产物通过改变前-mRNA的剪接，形成不稳定U2 snRNP/pre-mRNA复合物，从而阻止剪接体组装［25］。近年来，人工合成类似药物得到了快速发展，而人工合成类似药对改变pre-mRNA的剪接具有不同的作用机制，如吲哚类化合物抑制外显子剪接增强子，小分子激酶抑制剂通过阻止产物的磷酸化而调节其富-SR蛋白转录后的修饰，调节蛋白/蛋白和蛋白/RNA相互作用能识别正确的剪接位点等，使用反义寡核苷酸能纠正致瘤性mRNA的错误剪接［26］。合成类似物的生成必须确保其具有较强活性、稳定性和溶解性，目前用于剪接体靶向治疗的药物主要有：spliceostatin A、sudemycins、E7107及最新药物H3B-8800［27］。更适合称上述合成药物为剪接“调节体”而不是抑制体，因为它们改变剪接的方式极其复杂，而不仅是简单的下游调节。
2.1 spliceostatin A
FR901464是由假单孢菌产生的具有高效抗肿瘤活性的天然产物。2004年Motoyoshi等［28］研究首次报道了FR901464甲基化的衍生物，并命名为spliceostatin A，它具有与FR901464有相似的抗肿瘤活性。FR901464和spliceostatin A在体外实验中通过与SF3b的连接而促进pre-mRNA聚集［28］。spliceostatin A在继U2 snRNP组装之后通过干扰剪接体从而抑制pre-mRNA剪接，其剪接体组装的抑制需要ATP调节，从而保证pre-mRNA剪接序列和U1和U2 snRNAs的完整性。同时也证明此合成物具有抗肿瘤作用［25］。
2.2 sudemycin
sudemycin合成物类似于RNA剪接调节体FR901464和它的衍生物spliceostatin A。Fan等［26］研发的一种新的人工合成药物sudemycins，它具有与FR901464有相似的药效基团，对人类肿瘤细胞具有细胞毒性；同时sudemycins是强有力的调节体，能选择性剪接人类肿瘤细胞的内源性基因，其作为肿瘤治疗药物已经经历了临床前评估［29］。使用sudemycins治疗，U2AF1突变的小鼠比野生型更敏感。实验发现sudemycins具有抗肿瘤性并直接作用于SF3B突变因子，把人类的白血病细胞灌入免疫缺陷的小鼠中，低剂量的sudemycins就可以引起外周血和脾脏中的白血病细胞凋亡［30］。Shirai等［31］在体外实验中发现U2AF1（S34F）突变的细胞对剪接调节体药物sudemycin敏感，U2AF1（S34F）突变小鼠使用sudemycin治疗会导致U2AF1突变的衰减并诱导造血祖细胞的爆发。监管分析整个转录组序列发现在sudemycin影响的RNA剪接集中在U2AF1（S34F）和U2AF1（WT）突变的骨髓细胞中。
2.3 E7107
E7107是自然真菌产物pladienolide B的半合成氨基甲酸酯衍生物，通过抑制剪接体组装调节蛋白表达，在临床前实验中表现出独特而广谱的抗肿瘤作用。有实验发现E7107通过阻止U2 snRNP与pre-mRNA的连接而阻断剪接体的组装［32］。在SRSF2 P95H突变的白血病小鼠中，使用E7107治疗可以降低疾病的负荷，提高存活率和改善血细胞计数［33］。E7107用于实体肿瘤的临床试验发现，E7107通过pre-mRNA剪接的调解并增加内含子保留能有效的抑制肿瘤生长和外周血单核细胞数，可以有效地靶向剪接过程中的薄弱点，然而仍有5%患者出现视力丧失等不良反应，高剂量药物甚至可以引起胃肠道不良反应，进而导致试验终止［34］。
2.4 H3B-8800
在MDS患者人体试验中，H3B-8800是可以口服的小分子SF3B1调节体。剪接调节体作为新型的治疗方式具有巨大潜力，但也存在许多问题，如剪接调节体与SF3B结合的生化结构不清楚，关于其不良反应、准确作用方式以及靶向治疗方法等均需要在临床前和临床试验中解决。基于上述事实，因剪接体突变的白血病表现出对靶向剪接调节体独特的敏感性，亟需对剪接调节体的药理作用做更深入的研究。
3 总结和展望
综上所述，剪接体在MDS发生发展中的作用值得关注，但其致病机制尚未完全明确，如ZRSR2等因子是如何识别加工过程中的动态变化并准确选择剪接位点等。其次，RNA剪接调节体药物的发现，为血液学肿瘤提供了新的治疗方式。进一步阐明靶向药物的作用机制有利于理解和控制疾病的进程，而个性化的基因表达和全基因组的研究将促进个性化治疗模式的发展。
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Research progress on spliceosome mutations in myelodysplastic syndromes
Linna HUANG,Pengqin LIU,Guozhi DAI
Department of Clinical Laboratory,Chenzhou First People's Hospital Affiliated to University of South China,Chenzhou 423000,China
Guozhi DAI;E-mail:daigz008@126.com
Spliceosomal dysfunction plays a major role in pathogenesis of myelodysplastic syndrome(MDS).Splicing factor somatic mutations,including SF3B1,U2AF1(U2AF35),SRSF2,ZRSR2,PRPF40B,SF1,SF3A1,and U2AF2,comprise a common(45%-85%)class of mutated genes in MDS.These genes exist in a mutually exclusive manner at the 3ʹsplice site of mRNA processing and are predominantly heterozygous and missense.RNA splicing might have therapeutic and prognosis values in MDS.This review mainly describes the pathogenesis of common splicing factor gene mutations in MDS and discusses possible therapeutic implications,clinical analysis,and prognosis.
myelodysplastic syndromes,spliceosome,mutations,targeted therapy
10.3969/j.issn.1000-8179.2017.19.144
南华大学附属郴州第一人民医院检验科（湖南省郴州市423000）
代国知 daigz008@126.com
（2017-02-09收稿）
（2017-05-11修回）
（编辑：孙喜佳 校对：郑莉）
黄林娜 专业方向为临床检验诊断学。E-mail：43985296@qq.com
