广东省副猪嗜血杆菌的流行病学调查

佟铁铸，贾爱卿，樊惠英

（1.广东出入境检验检疫局，广州 5106233；2.华南农业大学兽医学院 农业部兽用疫苗创制重点实验室，广州510642；3.广东海大畜牧兽医研究院，广州 510000）

广东省副猪嗜血杆菌的流行病学调查

佟铁铸1，贾爱卿2,3，樊惠英2

（1.广东出入境检验检疫局，广州 5106233；2.华南农业大学兽医学院 农业部兽用疫苗创制重点实验室，广州510642；3.广东海大畜牧兽医研究院，广州 510000）

为了解副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，Hps）在广东省的流行情况，采用细菌分离鉴定和PCR方法对广东省79家规模化猪场的227头疑似关节炎、多发性浆膜炎的发病猪进行了检测。结果显示，副猪嗜血杆菌阳性率达22.74%。对猪场全年发病情况进行数据统计分析，发现1～3月Hps阳性率最高。使用间接血凝试验方法对55株临床分离株进行血清学分型，结果显示5型（23.68%）最为流行，其次是12型（13.16%）和4型（10.53%）。

副猪嗜血杆菌；流行病学；调查

副猪嗜血杆菌病，又称革拉泽氏病(Glasser's disease)，是由副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，Hps）引起的一种以呼吸道症状，跛行，胸膜炎、心包炎、腹膜炎、关节炎和脑膜炎等为特征的猪呼吸道传染病[1,2]。副猪嗜血杆菌病是影响全球养猪业的一种重要细菌性疾病。Hps只感染猪，可影响2周龄到4月龄的猪，常见于5～8周龄的猪。副猪嗜血杆菌病主要在断奶后和保育阶段发病，发病率一般为l0%～15%，严重时死亡率可达50%[3-5]。

本研究通过细菌形态学、培养特性和生化特性以及PCR方法进行鉴定，从病料中成功分离到Hps。再用间接血凝方法对分离到的菌株进行血清学分型，初步了解广东省副猪嗜血杆菌病的流行情况，为广东省的副猪嗜血杆菌病的防控提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 临床病料 从2013年1月～2015年11月，在广东省79家规模化猪场共采集发病猪277份病料。发病猪多表现为咳嗽、打喷嚏、呼吸困难，鼻腔有分泌物，消瘦、生长缓慢、跛行等。部分猪表现为发热，腹泻，耳和四肢末端皮肤发紫，急性死亡等症状。剖检病变表现为胸膜炎、腹膜炎、心包炎、关节炎和脑膜炎等[6,7]。

1.2 主要仪器设备与试剂 电子天平购自上海精密科学仪器有限公司天平仪器厂；凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司；My Cycler TM型PCR仪购自美国Bio-Rad公司；超净工作台购自苏州净化设备厂；电泳仪购自美国Bio-Rad公司；恒温水浴器购自江苏国华电器有限公司；超纯水仪购自法国Millipore公司；高速离心机购自德国Eppendorf公司；高压蒸汽灭菌锅购自上海医用核子仪器厂；生化培养箱购自上海精宏实验设备有限公司。

胰蛋白大豆琼脂（TSA）、胰蛋白大豆肉汤（TSB）均为OXOID公司产品；新生牛血清为杭州四季青材料有限公司产品；辅酶I (烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，NAD) 为上海化学试剂公司产品；dNTPs、ExTaq酶、电泳缓冲液TAE（50×）购自宝生物工程（大连）有限公司；微量生化鉴定试剂为杭州天和微生物试剂有限公司产品；阳性血清，阴性血清均为实验室保存。

1.3 病原菌的分离 分别从疑似病猪的肺脏、鼻腔、肝脏、胸腹腔积液、脾脏、肾脏、心脏和关节液等病料中无菌操作取样，在TSA固体培养基上分别划线接种，37℃培养48～72 h后挑取单个菌落，进行纯培养并鉴定[8]。

1.4 革兰氏染色镜检 挑取1.3获得的单菌落涂片，进行革兰氏染色。

1.5 生化鉴定 用接种环分别挑取1.3获得的单菌落，纯培养后接种于脲酶、氧化酶、接触酶、硝酸盐还原、吲哚、葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、核糖和麦芽糖等微型生化鉴定管观察结果。

1.6 PCR检测 将被检菌株培养液12 500 ×g离心5 min，弃上清液，用无菌水重悬，然后在沸水中水浴10 min，再置-20℃冻结，室温融化后12 500 ×g离心5 min，取上清液作模板[9]。根据Hps 16S rRNA序列设计引物[10]，由上海生工公司合成。上游引物：5'-GGC TTC GTC ACC CTC TGT -3'；下游引物：5'-GTG ATG AGG AAG GGT GGT GT -3'。以10 μL DNA为模板，上下游引物各1 μL，然后分别加入5 μL 10×reaction buffer、0.5 μL Ex Taq酶（TaKaRa公司）、2.5 mmol/L dNTP 5 μL 、27.5 μL DEPC水，共50 μL。94℃预变性4 min；PCR反应条件：94℃变性50 s，59℃退火50 s，72℃延伸1 min，运行30个循环；最后72℃延伸10 min。

1.7 间接血凝试验血清学分型方法的操作步骤 无菌采集健康公绵羊颈静脉血液200 mL，于400 mL灭菌阿氏液中，4℃静置3 d，无菌双层纱布过滤，500×g离心4 min。用PBS（pH7.4）洗5次，每次500×g离心5 min，配成3%的绵羊红细胞悬液4℃保存，1周内使用。取300 μL上述待检Hps温水抗原，加入2700 μLPBS（pH7.4），混匀后加入3000 μL 3%绵羊红细胞，37℃水浴90 min，其间每隔10 min轻轻摇晃，保持红细胞悬浮。将上述致敏红细胞用PBS（pH7.4）清洗3次，每次500×g离心5 min，重悬于pH7.4 PBS中即为致敏好的绵羊红细胞，4℃保存，1周内使用。

取微量血凝板2块，按次序编号为1～15行，每孔加入25 μL/生理盐水，然后将15株标准血清型Hps的高免血清25 μL，按次序分别加入每行的第1孔中。混匀后，每行倍比稀释至第10孔，弃去第10孔吸出的血清，第11孔为阴性对照，第12孔为凝集对照；每行的1～10孔内各加入25 μL的待检菌株的抗原，每行第11孔分别加入未免疫的新西兰大白兔阴性血清，每行第12孔加入相应标准血清型的Hps菌株的抗原。最后每孔加入50 μL 3%致敏的绵羊红细胞，在微量震荡器上振荡混匀，室温下作用30 min后观察结果[11,12]。

2 结果

2.1 副猪嗜血杆菌的检测结果 通过细菌形态学、培养特性和生化特性观察，以及PCR鉴定，从广东省送检的疑似病猪的277份病料中检测到63株Hps，分离到55株Hps，阳性率为22.74%，病料分离率为19.86%。1～3月从25家猪场检测出Hps阳性猪场11家，Hps阳性检出率为44%；4～6月从30家猪场检测出Hps阳性猪场10家，Hps阳性检出率为33.33%；7～9月从24家猪场检测出Hps阳性猪场4家，Hps阳性检出率为16.67%；10～12月从13家猪场检测出Hps阳性猪场3家，Hps阳性检出率为23.08%。

2.2 菌落特征与细菌形态 Hps在TSA固体培养基上，37℃培养24～48 h后，菌落呈圆形、光滑湿润、无色透明、直径1～2 mm，见图1。革兰染色显示为革兰氏阴性细小杆菌，具有多种不同的形态，有单个的球杆菌以及长的、细胞的以致丝状的菌体，见图2。

图1 副猪嗜血杆菌在TSA 固体培养基上37℃培养24 h的菌落形态Fig. 1 Colony morphology of Haemophilus parasuis on a TSA solid medium at 37°C for 24 h

图2 副猪嗜血杆菌革兰染色镜检Fig. 2 Microscopy of Hps Gram staining

2.3 生化鉴定 多数Hps分离株只发酵果糖、葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖，不发酵棉籽糖、乳糖、蜜三糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖，甘露醇，尿素试验阴性，氧化酶试验阴性，接触酶试验阳性，硝酸盐还原试验阳性，吲哚试验阴性（表1）。

表1 部分副猪嗜血杆菌分离株的生化鉴定结果Table 1 Biochemical identi fi cation of some Haemophilus parasuis isolates

2.4 PCR鉴定 根据副猪嗜血杆菌16S rRNA序列设计引物，经PCR扩增，产物为822 bp大小的片段，见图3。

2.5 广东部分猪场副猪嗜血杆菌血清型鉴定 采用间接血凝试验方法对55株Hps分离株进行血清学分型， 分型结果显示以5型（23.68%）最为流行，其次是12型（13.16%）居多，其次分别是血清4型（10.53%）、14型（7.89%）、10型（5.26%）、1型（2.63%）和15型（2.64%），另外有34.21%不能定型，见图4。

图3 副猪嗜血杆菌16S rRNA PCR扩增结果Fig.3 The results of 16S rRNA PCR ampli fi cation of Haemophilus parasuis

图4 55株临床分离株血清型分布图Fig. 4 The serotype distribution of 55 clinical isolates

3 讨论

副猪嗜血杆菌是猪上呼吸道的常在菌，在不利的饲养环境和其他病原菌侵袭下，能迅速侵入主要器官，引起以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征的格拉泽氏病[13,14]。由于猪感染Hps后，其临床症状、肉眼观察病理变化等与猪链球病、支原体性肺炎和传染性胸膜肺炎等都有相似之处，容易混淆，所以副猪嗜血杆菌病较难鉴定。因此，对于Hps的分离鉴定是临床上最准确有效的诊断方法。Hps生长所需营养条件高、生长速度缓慢、死亡快，培养难度较大；另外，针对Hps的选择培养基目前还未见报道，所以Hps的分离鉴定就有很大难度。PCR方法具有简便、快速、灵敏度高等优点，能加快对于Hps的准确诊断，提高Hps的分离效率。

本研究对广东省的277份病料先通过PCR的方法将阳性病料选出，然后在含有犊牛血清、NAD的TSA平板上分离出多数的病原菌，再将单菌落接种于含有犊牛血清、NAD的TSA平板和不含有犊牛血清、NAD的TSA平板上，区分Hps和猪链球菌[15,16]。最后，通过微生物学镜检、生化试验以及PCR方法对分离菌株进行鉴定，保证了分离的菌株为Hps。277份病料共检测到Hps63株，其中分离到55株Hps，阳性率为22.74%，病料分离率为19.86%。结果表明，Hps在我国广东省猪场中普遍存在。另外通过对猪场全年不同季度发病情况的数据统计，发现其中以1～3月阳性率最高，这可能与广东地区1～3月气温低，猪的抵抗力相对较弱，而天气比较潮湿，温度、湿度等条件比较适合细菌繁殖有关。

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EPIDEMIOLOGICAL INVESTIGATION OF HAEMOPHILUS PARASUIS IN GUANGDONG PROVINCE

TONG Tie-zhu1, JIA Ai-qing2,3, FAN Hui-ying2

(1. Guangdong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Guangzhou 5106233, China; 2. Key Laboratory for Animal Vaccine
Development of Ministry of Agriculture, College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China; 3.Guangdong Haid Institute of Animal Husbandry & Veterinary,Guangzhou 510000,China)

In order to understand the epidemiology of Haemophilus parasuis in Guangdong province, 227 cases of suspected arthritis and multiple serositis from 79 large-scale swine farms in Guangdong province were tested using bacterial isolation and nucleic acid ampli fi cation method. The results showed that the positive rate of Haemophilus parasuis was 22.74%. Statistical analysis of the incidences of pig farms in different quarters of a year revealed that the positive rate was the highest in the fi rst three months. Fifty- fi ve clinical isolates were obtained and serotyped using indirect hemagglutination test. The most prevailing serotype was type 5 (23.68%), followed by serotype 12 (13.16%) and serotype 4 (10.53%).

Haemophilus parasuis; epidemiological; investigation

S852.612

A

1674-6422（2017）05-0042-05

2017-02-06

公益性行业项目（201303034）

佟铁铸，男，硕士研究生，预防兽医学专业

樊惠英，E-mail：13829915152@163.com