姜黄素对猪圆环病毒灭活苗细胞免疫效果的影响

余建国，周 立

（浙江省金华职业技术学院，金华 321007）

·简报·

姜黄素对猪圆环病毒灭活苗细胞免疫效果的影响

余建国，周 立

（浙江省金华职业技术学院，金华 321007）

为评价姜黄素对猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）灭活疫苗在仔猪免疫效果中的作用，将60头三元杂交仔猪随机平均分成3组，Ⅰ组于14日龄注射PCV2灭活疫苗1头份+姜黄素0.5 mL，Ⅱ组于14日龄注射PCV2灭活疫苗1头份+姜黄素1 mL，对照组于14日龄接种PCV2灭活疫苗1头份。结果显示，Ⅰ组和Ⅱ组仔猪淋巴细胞转化率均高于对照组，差异具有显著统计学意义，外周血NK细胞数量和淋巴细胞数量也显著增加。结果表明PCV2灭活疫苗与姜黄素联合应用，可提高仔猪对PCV2的细胞免疫水平，且在一定剂量范围内，姜黄素浓度增加有利于免疫活性的增强。

姜黄素；PCV2；灭活疫苗；细胞免疫；仔猪

猪圆环病毒病是当前一种重要的猪传染病，对我国养猪业造成了严重的经济损失。猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）灭活疫苗有较好的安全性和免疫保护效力[1]，但临床应用发现，PCV2灭活疫苗免疫后存在空白期比较长，免疫保护期比较短等缺点。

姜黄素是一种黄色素，从姜黄中提取，多用于食品着色，是一种常用的天然色素。诸多研究表明，姜黄素具有抗炎、抗氧化、降血脂、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤、抗人免疫缺陷病毒等作用[2]，且副作用极小，药源稳定，提取便利，在临床上得到广泛的使用。安全性评估研究表明姜黄素具有较好的耐受性，是一种具有广泛应用前景的新药。

目前，国内外对姜黄素的研究主要集中于药物代谢动力学以及抗肿瘤、抗炎和抗病毒效应，而对机体的免疫调节研究较为少见，关于免疫调节的机制更是鲜见报道。姜黄素对自由基的清除作用和诱导凋亡的作用都提示它存在免疫调节的潜力。具有邻二羟基基因的姜黄素在抗氧化过程中，会产生稳定性很好的醌类物质，使其成为抗氧化物质的冠军。姜黄素具有较强的抗自由基，抗脂质过氧化和稳定细胞膜的作用，可抑制氧自由基的产生，增加谷胱甘肽的水平，进而保护机体组织器官免受侵害[3]。有研究表明，姜黄素能促进淋巴细胞转化，刺激B细胞增殖、分化和免疫球蛋白产生，促进T细胞生长[4]。本试验将中药姜黄素与猪PCV2灭活疫苗联合应用，研究其对仔猪细胞免疫效果的影响。

1 材料和方法

1.1 主要试验材料与仪器 姜黄素溶液（1 g/mL灭菌悬液）由安吉丰牧兽药公司提供(中试液）；PCV2灭活疫苗（WH株）购自中牧股份有限公司（150918）；猪圆环病毒酶联免疫诊断试剂盒购自杭州康嘉动物营养科技公司；Uritest－3000型全自动血细胞分析仪为优利特集团有限公司产品。

1.2 试验猪的选择与分组 选用温岭市某猪场提供的遗传背景相近、经ELISA检测PCV2抗体一致（P＞0.05）的14日龄“杜洛克×（长白×大约克）”三元杂交健康仔猪60头，随机分为3组。常规饲养管理，自由采食和饮水。Ⅰ组于14日龄颈部肌肉注射PCV2灭活疫苗1头份+姜黄素0.5 mL混合液；Ⅱ组于14日龄颈部肌肉注射PCV2灭活疫苗1头份+姜黄素1 mL 混合液；对照组于14日龄颈部肌肉接种PCV2灭活疫苗1头份+1 mL生理盐水混合液。

1.3 样品的采集 免疫后d21、35、49，分别从各组随机选取5头仔猪，每头仔猪采集静脉血液2份。其中，1份2 mL肝素钠抗凝，用于血液淋巴细胞转化试验；1份EDTA-K2抗凝血1 mL，用于血细胞分类计数。

1.4 检测指标及方法

1.4.1 血液淋巴细胞转化率测定 参照文献[5]，采用四甲基偶氮唑盐法（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）。

1.4.2 NK细胞活性测定实验 采用乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）测定法。免疫后d21、35、49，分别从各实验组随机选取3头仔猪，处死后无菌取脾脏，进行研磨，制成单个细胞悬液；离心，弃上清，将细胞加入0.5 mL灭菌水20 s，裂解红细胞后加入0.5 mL的2倍Hank’s液及8 mL Hank’s液；离心，将细胞悬浮于1640培养液中，用1%冰醋酸稀释，计数并调整细胞浓度为2×107个/mL。实验前24 h将靶细胞（YAC - 1细胞）传代培养，调整细胞浓度为4×105个/mL。取YAC-1细胞和培养液各100 μL加入96孔培养板，YAC-1细胞自然释放孔加YAC-1细胞和培养液各100 μL，YAC-1细胞最大释放孔加YAC-1细胞和1%1640各100 μL，均设3个重复[6]。5%CO2条件下37℃孵箱培养4 h，离心，取上清100 μL。置于96孔培养板，同时加入LDH基质液100 μL，反应5 min，每孔加入1 mol/L的HCl30 μL，酶标仪于490 nm处检测光密度值，取3个数平均值。

1.4.3 外周血细胞分类计数的测定 采用全自动血细胞分析仪（Uritest－3000）测定对外周血细胞分类计数。

1.5 数据处理与分析 采用SPSS16.0统计软件进行统计分析和LDS多重比较。

2 结果与讨论

2.1 姜黄素对仔猪淋巴细胞转化率的影响 采用MTT法测定血液淋巴细胞转化率，结果显示，I组和II组不同日龄仔猪淋巴细胞转化率均高于对照组，差异具有显著统计学意义（P＜0.05）。Ⅱ组不同日龄仔猪淋巴细胞转化率均高于试验Ⅰ组，差异具有显著统计学意义（P＜0.05）（表1）。结果表明，姜黄素与PCV2灭活疫苗联合免疫能显著提高细胞免疫活性，且在一定剂量范围内，随姜黄素浓度增加而增强。可见，PCV2灭活疫苗加入外源性姜黄素，淋巴细胞增殖反应上升，明显提高血液中淋巴细胞转化能力，有效促进仔猪的细胞免疫功能，这与金光明等[7]研究结果相一致。

姜黄素在体外能直接促进或协同细胞表达的凝集素ConA，促进仔猪脾脏T淋巴细胞的增殖反应，加速细胞免疫机能的完成[8]，从而加强对外界刺激的免疫应答。姜黄素能提高T淋巴细胞的转化率，且与剂量有关，推测该机制与抑制免疫细胞NF-κB的活化有关。

表1 姜黄素对仔猪血液淋巴细胞转化率的影响Table 1 Effect of curcumin on lymphocyte transformation rate of piglets

2.2 姜黄素对仔猪NK细胞活性的影响 采用LDH法测定血NK细胞活性，结果显示实验组不同日龄NK细胞活性均高于对照组，差异具有显著统计学意义（P＜0.05），Ⅱ组不同日NK细胞活性均高于Ⅰ组，差异具有显著统计学意义（P＜0.05）（表2），表明姜黄素与PCV2灭活疫苗联合免疫能显著提高NK细胞免疫活性，且在一定剂量范围内，随姜黄素浓度增加而增强。

结果提示，姜黄素能通过持续增强仔猪NK细胞的活性，表现出一定的免疫增强作用。活化的NK细胞可以合成和分泌细胞因子，发挥和调节免疫和造血作用以及直接杀死靶细胞作用。加入姜黄素后，NK细胞活性明显提高，原因可能是姜黄素具有较强的抗自由基、抗脂质过氧化和稳定细胞膜作用, 并可抑制黄嘌呤脱氢酶向黄嘌呤氧化酶的转化，从而抑制氧自由基产生，增加谷胱甘肽的水平，进而保护机体组织器官免受侵害[9,10]。

表2 姜黄素对仔猪NK细胞活性的影响(±s)Table 2 Effect of curcumin on NK cell activity of piglets

表2 姜黄素对仔猪NK细胞活性的影响(±s)Table 2 Effect of curcumin on NK cell activity of piglets

注: 同列标有不同小写字母者表示差异具有显著统计学意义(P＜0.05), 标有不同大写字母者差异极显著(P＜0.01)，标有相同字母者表示差异不具有显著统计学意义(P＞0.05)Note: The values with different superscripts letter in the same column indicated there were signi fi cant difference between groups(P＜0.05), with the same superscripts capital letter indicated insigni fi cant difference(P＞0.05)

天数Days组别Group NK细胞活性NK cell activity（%）21试验Ⅱ组67.25±10.58a试验Ⅰ组58.25±13.33b对照组48.53±9.87c 35试验Ⅱ组76.95±14.13a试验Ⅰ组64.78±13.42b对照组49.64±12.62c 49试验Ⅱ组83.67±8.57a试验Ⅰ组74.24±13.64b对照组65.73±6.89c

2.3 姜黄素对仔猪外周血细胞分类计数的影响 采用全自动血细胞分析仪对外周血细胞分类计数，结果显示，首免后21 d和35 d试验组外周血白细胞数量和淋巴细胞数量高于对照组和空白组，差异具有显著统计学意义（P＜0.05），首免后35 d对照组外周血白细胞数量和淋巴细胞数量高于空白组，差异具有显著统计学意义（P＜0.05），红细胞和中性粒细胞数量有上升的趋势，但差异不具备显著统计学意义（P＞0.05）（图1），表明姜黄素与PCV2灭活疫苗联合免疫比单独使用PCV2灭活疫苗免疫能增加外周血白细胞数量和淋巴细胞数量，增强细胞免疫功能。

血细胞是参与机体免疫反应的主要成分[11,12]，本研究中，实验组比对照组仔猪外周血红细胞和中性粒细胞数量有所上升，外周血白细胞数量和淋巴细胞数量显著增加，这在一定程度上说明姜黄素对仔猪的血红蛋白合成、造血功能的提高有促进作用，有利于提高机体非特异性免疫力和清除体内的病原微生物，增强细胞免疫功能。

图1 姜黄素对仔猪外周血细胞分类计数的影响Fig.1 Effects of curcumin on peripheral blood cell differential counts of piglets

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ENHANCEMENT OF CURCUMIN ON IMMUNE RESPONSE OF INACTIVATED PORCINE CIRCONVIRUS TYPE 2 VACCINE IN PIGS

YU Jian-guo, ZHOU Li

(Jinhua Polytechnic, Zhejiang Province, Jinhua 321007, China)

The purpose of this experiment was to evaluate the enhancement effect of curcumin on inactivated Porcine circovirus type 2(PCV2) vaccine. Sixty piglets were randomly divided into 3 groups, 20 pigs each and immunized at 14-days old. The piglets in group 1 were injected with one dose of PCV2 vaccine plus 0.5 mL curcumin liquid, group 2 with one dose of PCV2 vaccine plus 1 mL curcumin liquid and group 3 with one dose of PCV2 vaccine only. Blood samples were collected and lymphocyte transformation was examined. The results showed signi fi cantly higher lymphocyte transformation in curcumin groups 1 and 2 than non-curcumin control group as evaluated from lymphocyte and NK cell counts.

Curcumin; PCV2; inactivated vaccine; cellular immunity; piglets

R282.710.5

B

1674-6422（2017）05-0060-04

2016-08-16

浙江省公益科技项目（2011c22093）

余建国，男，副教授，主要从事动物传染病及免疫教学科研工作

余建国，E-mail：yjg-74@163.com