基于12S rRNA基因序列的犬弓首蛔虫种系发育关系分析

（1.河南省济源市畜产品质量监测检验中心，济源 459000；2.河南省平顶山市畜牧技术推广站，平顶山 467000）

项黎丽1，苏玉贤2

基于12S rRNA基因序列的犬弓首蛔虫种系发育关系分析

（1.河南省济源市畜产品质量监测检验中心，济源 459000；2.河南省平顶山市畜牧技术推广站，平顶山 467000）

本次研究旨在分析河南省不同地区犬弓首蛔虫分离株线粒体12S rRNA部分基因序列（plastiosome 12S rRNA，p12S rRNA）的遗传变异情况。通过PCR技术对犬弓首蛔虫p12S rRNA序列进行扩增并测序，应用ClustalX 2.0程序对序列进行比对，再利用Mega4.0程序进行NJ法绘制种系发育树。结果显示，所获得的18个犬弓首蛔虫分离株p12S rRNA序列长度为497～499 bp。种系发育分析结果显示，所有的犬弓首蛔虫分离株与已知犬弓首蛔虫位于同一分支，与其他蛔虫所属分支相隔较远。犬弓首蛔虫p12S rRNA序列种内相对保守，而种间差异较大，可以作为种间遗传变异研究的标记，从而为犬弓首蛔虫的分类与流行学调查奠定了基础。

犬弓首蛔虫；线粒体DNA；12S rRNA基因；种系发育关系

项黎丽1，苏玉贤2

犬弓首蛔虫病是由犬弓首蛔虫（Toxocara canls）感染引起的人畜共患寄生虫病，其成虫主要寄生于犬、猫和狐等犬科动物的胃部和小肠内，宿主主要表现消瘦、异嗜、食欲不振、消化不良等临床症状，严重时可导致死亡，剖检可发现宿主小肠和胃部有大量成虫[1]。人类经口误食感染性虫卵后可导致幼虫在其肌肉、眼睛和大脑中移行，引起严重的病例综合症[2,3]。犬弓首蛔虫在全世界分布广泛，据国外学者报道，其感染率为5.3%～64.7%[4-6]。我国的犬弓首蛔虫病感染率为8.13%～77.4%[7,8]。近年来，随着宠物犬饲养量的剧增，弓首蛔虫病感染率也呈逐年上升趋势。同时，犬弓首蛔虫对犬、猫和狐等犬科动物的健康成长产生了极大的危害，给相关养殖业带来了巨大的经济损失。因此，准确鉴定出犬弓首蛔虫，对遏制其流行与防制具有重要的意义。

随着科学技术的飞速发展，分子遗传研究已广泛应用于寄生虫的分类学、遗传变异和分子流行学中来，相关研究表明，线粒体基因（mitochondrial DNA，mtDNA）具有分子结构简单、无重组、进化速率快、母系遗传、拷贝数多等优点[9]，其中线粒体12S rRNA 基因也可以作为分子标记应用于寄生虫的分子鉴定和种系发育研究中[10,11]。本研究通过对河南省不同地区犬弓首蛔虫分离株线粒体12S rRNA基因进行扩增并分析，探讨其与其他蛔虫的亲缘关系，从而明确线粒体12S rRNA基因是否可以作为分子种间遗传标记，为犬弓首蛔虫的鉴定、分类和分子流行病学调查以及防治等研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 虫体样品 本研究所采集的18株样品分别来自于河南省郑州市（ZZ1-2）、开封市（KF1-2）、洛阳市（LY1-2)、安阳市（AY1-2）、鹤壁市（HB1-2）、新乡市（XX1-2）、许昌市（XC1-2）、洛河市（LH1-2）和焦作市（JZ1-2），所采集样品均来自于犬肠道。

1.2 主要试剂 PCR试剂（Buffer、MgCl2、dNTP等）、DNA提取试剂盒、DL2000 Marker等均购自于宝生物工程（大连）有限公司；蛋白酶K为Merck公司产品。

1.3 基因组DNA的制备 取出70%酒精保存的虫体，用蒸馏水反复冲洗5次，每次6 min。用无菌镊子取出虫体的一部分置于灭菌的1.5 mL Eppendorf管中，用灭菌的微型剪刀将虫体彻底剪碎，加入200 μL GA buffer溶液与20 μL蛋白酶K，混匀后，放在65℃培养箱2～3 h（每30 min混匀1次）。将消化好的虫体悬浮液体按使用说明书提取虫体DNA，并置于－20℃冰箱保存备用。

1.4 PCR扩增 采用引物12SF和12SR[12]对犬弓首蛔虫线粒体p12S rRNA 进行扩增，12SF：5'-GTTCCA GAATAATCGGCTA-3'，12SR：5'-ATTGACGGAT GAGTTTGTACC-3'，由上海生工生物科技技术有限公司合成。扩增体系为25 μL：双蒸水13.25 μL，2×Taq PCR Master Mix 8.5 μL、rTaq DNA聚合酶（5 U/μL）0.25 μL、上下游引物（10 pmol/μL）各0.5 μL、模板DNA 2 μL，同时设置无菌双蒸水作阴性对照。扩增条件为：94℃预变性3 min；然后94℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，共31个循环；最后以72℃延伸5 min。取5 μL PCR产物在1%TAE琼脂糖凝胶电泳，利用紫外投射仪观察实验结果，将阳性产物送至上海生工生物技术有限公司测序。

1.5 数据分析 利用DNAstar软件对测序结果进行分析，从GenBank检索具有代表性的蛔虫p12S rRNA进行相似性对比和种系发育分析，以双盲小口线虫（Contracaecum osculatum，登录号：JF713818.1）作为外群，用Clustal X 2.0 软件和Mega4.0软件对p12S rRNA 序列进行对比及计算遗传差距，然后用Mega4.0软件中的临接法（neighbor-joining, NJ）绘制种系发育树，进行重复自举检验（Bootstrap test）1000次。

2 结果与讨论

2.1 PCR扩增结果 18个犬弓首蛔虫样品均成功扩增约500 bp的片段，与预期片段长度相符，无非特异性条带，且空白对照为阴性。其中9个样品PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。

2.2 测序与序列分析结果 测序结果显示，由引物12SF和12SR扩增出犬弓首蛔虫p12S rRNA片段大小为497～499 bp，与Wickramasinghe等[12]所扩增12S rRNA基因片段长度一致。对18个p12S rRNA样品序列进行种内差异对比，结果显示，18个分离株样品之间的p12S rRNA序列核苷酸序列的变异性很小（0～0.8%），序列差异主要表现为碱基互换、插入和缺失。河南省18个样品p12S rRNA序列与GenBank收录的弓首蛔虫分离株（登录号：FJ4 18782.1）相似度均高于98.2%，与其他蛔虫分离株p12S rRNA序列的同源性均低于82.3%。以序列碱基组成为视角，12S rRNA序列的A、T、C、G四个碱基平均含量分别为30.84%、38.07%、9.40%和21.69%，A+T碱基含量为68.92%，明显高于C+G碱基含量（31.08%），具有明显的AT碱基偏倚性，这与李明伟[13]对犬弓首蛔虫的研究结果相符。

2.3 12S rRNA序列系统发生树 根据参考序列的长度，经过比对后除去多余的序列，选用所测序列为430 bp。通过种系发育分析，结果显示，河南省9个不同地区18个样品分离株12S rRNA序列具有高度的同源性，和GenBank中收录的犬弓首蛔虫分离株（FJ4 18782.1）位于同一分支，系统发生树中的Bootstrap值较高，且与其他蛔虫所属分支相隔较远，得到了很好的鉴别（图2）。可见线粒体12S rRNA基因可以作为遗传标记基因应用于犬弓首蛔虫的分子鉴定、分类学和种系发育等系列研究，本研究结果为犬弓首蛔虫病的诊断、防制及进一步的分子学研究提供了科学依据。

图1 犬弓首蛔虫线粒体12S rRNA PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析Fig.1 Analysis of PCR-ampli fi ed mtDNA 12S rRNA from Toxocara canls by agarose gel electrophoresis

图2 基于12S rRNA 基因序列所构成的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of 12S rRNA sequence using neighbor-joining method

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PHYLOGENETIC ANALYSIS OF MITOCHONDRIAL 12S rRNA GENE OF TOXOCARA CANLS IN HENAN PROVINCE

XIANG Li-li1, SU Yu-xian2

(1. Livestock Product Quality Surveillance Test Center of Jiyuan City, Henan Province, Jiyuan 459000, China; 2. Animal Husbandry and Veterinary Station of Pingdingshan City Henan Drovince, Pingdingshan 467000, China)

The aims of the present study were to analyze sequence variations in the mitochondrial 12S rRNA gene among Toxocara canls isolates from Henan province. The 12S rRNA was ampli fi ed from each of Toxocara canls isolates by PCR and analyzed using the ClustalX 2.0. The results showed that the lengths of all the 12S rRNA sequences were 497 - 499 bp. The 12S rRNA sequences of the Henan isolates and reference Toxocara canls available in GenBank were aligned for phylogenetic analysis and found that they all clustered in the same clade. Therefore, 12S rRNA sequence could be used as a genetic marker for population genetic studies of ascarid. The results of the present study provided foundation for further studies of diagnosis and molecular epidemiology of Toxocara canls.

Toxocara canls; mitochondrial DNA; 12S rRNA gene; phylogenetic relationship

S852.731

B

1674-6422（2017）05-0064-04

2016-12-23

平顶山市科技发展计划项目（20160315-N02）

项黎丽，女，兽医师，主要从事畜禽疫病防治研究

苏玉贤，E-mail：634379495@qq.com