大肠杆菌植酸酶appA基因的克隆、表达及性质分析

冉瑞法,刘淑娟,肖圣燕,冯 蔚,李镇刚

(云南省农业科学院 蚕桑蜜蜂研究所,云南 蒙自 661101)

大肠杆菌植酸酶appA基因的克隆、表达及性质分析

冉瑞法,刘淑娟,肖圣燕,冯 蔚,李镇刚*

(云南省农业科学院 蚕桑蜜蜂研究所,云南 蒙自 661101)

通过维生素C-钼蓝法，从饲喂青饲料的猪的粪便中分离筛选出1株产较高活性appA植酸酶的大肠杆菌菌株；采用PCR方法从该菌株的基因组中克隆获得植酸酶appA基因,测序结果显示PCR产物全长1447 bp,该植酸酶基因编码区有1296个核苷酸,编码432个氨基酸。将该编码区克隆至pPIC9K载体，并转化入巴斯德毕赤酵母进行甲醇诱导表达,获得了约55 kDa的特征条带,表达96 h后其上清液的酶活力达到368 U/mL。经Ni亲和柱纯化后进行部分酶学性质分析，结果表明：重组appA植酸酶的最适反应温度为55 ℃,温度高于60 ℃后其酶活下降明显；其最适pH值为5.0。

植酸酶;appA基因;大肠杆菌;克隆;表达；毕赤酵母

生态环境的良性循环是社会、经济实现可持续发展必备的基础条件,而环境的保护则是生态环境建设的重要任务。从磷对环境的污染而言,养殖业对于环境的磷污染主要是因为植物性饲料中的磷有2/3为植酸磷[1],单胃畜禽动物根本无法完全利用这些磷[2]，且植酸能够与矿物质营养元素和蛋白质等螯合,因而不能被完全吸收利用[3]，从而导致植物性饲料的营养价值下降。据报道，在玉米和小麦中,植酸及其螯合物中的磷仅有10%可被家禽消化利用,剩下的磷经动物消化道排出，会对环境造成磷污染[4]；同时在单胃动物饲料中还需要添加无机磷如磷酸氢钙等，这会增加饲料的成本。植酸酶是催化植酸及其盐水解成肌醇和磷酸的一类酶的总称[5]。目前对植酸酶的研究多集中于真菌和细菌上。马恒甲等[6]通过在草鱼饲料中添加植酸酶证明了其对植物性饲料的消化具有正向效应;梁欣等[7]的研究表明植酸酶在家禽饲料中的添加对植酸磷的消化利用具有不可替代的作用;刘晋生[8]证明了在猪饲粮配制中添加转基因植酸酶玉米可提高饲粮消化能值和非植酸磷含量,从而减少无机磷源的添加量。

一方面磷在动物饲料中是仅次于能量和蛋白质的第三位营养素,另一方面世界上大部分的农田土壤缺磷,我国土壤约2/3严重缺磷。国家农业部在2008年6月10日印发了《饲用植酸酶使用指南》,要求在饲料生产加工企业和规模化的养殖场推广使用植酸酶,以减少外源磷的添加量,降低饲料成本，减轻单胃畜禽排放磷对环境的污染。因而对植酸酶的研究显得日益重要,提高植酸酶的活性、寻找新的高酶活性植酸酶具有重要的经济、生态以及社会意义。来源于大肠杆菌的酸性植酸酶(appA)在现今已有报道中比活性最高[9-10]。本研究利用维生素C-钼蓝法从饲喂青饲料的猪的粪便中筛选获得了具有较高appA植酸酶活性的大肠杆菌菌株，从其基因组中克隆获得了appA基因,并利用巴斯德毕赤酵母表达系统对其表达及酶学性质进行了初步分析,旨在为植酸酶的利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料和主要试剂

于农户家猪圈采集主要饲喂青饲料的猪的新鲜粪便，装入离心管中，及时带回实验室备用。T4 DNA连接酶、限制性内切酶(XbaⅠ、EcoRⅠ、SacI)、克隆菌株DH5α感受态细胞、pMD19-T载体、低分子量蛋白质Marker、Plasmid Mini Kit I试剂盒、Gel Extraction Kit试剂盒购自TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司; PfuDNA聚合酶、植酸钠、EDTA、乙酸钠、甲醇、钼酸铵、甘氨酸、生物素、丙烯酰胺、N,N-甲叉双丙烯酰胺、TEMED、Tryptone powder、YNB、Tris、NaCl、CaCl2、Yeast extract、三氯乙酸(TCA)、SDS等均为分析纯,购自上海生工生物工程有限公司;质粒pPIC9K和巴斯德毕赤酵母GS115(His+)由实验室保存。

1.2 主要生化试剂及培养基的配制

LB培养基:1%胰蛋白胨、0.5%酵母膏、1%NaCl。溶液I:50 mmol/L葡萄糖、25 mmo1/L Tris-HCl、10 mmol/L EDTA, pH 8.0。磷标准储备液(5 mmol/L):精确称取0.68 g在105 ℃下干燥过的KH2PO4,溶于1000 mL双重蒸馏水中。三氯乙酸TCA (15%):在装有500 g TCA的瓶中加入227 mL水,形成的溶液为100%TCA (w/v)；将15 mL 100%TCA加入装有85 mL水的容量瓶中。醋酸缓冲液(0.25 mol/L):称取14.355 g无水乙酸钠,加入1.0 g吐温-20和30 g EDTA,用900 mL水溶解,用冰乙酸调pH值至5.50±0.01,用水定容至1000 mL,现用现配。AMES显色液: A液为10%维生素C溶液;B液为0.42%钼酸铵溶解于1 mol/L硫酸的溶液;显色液为A液与B液以体积比1∶6配制的混合液,现用现配。反应液:精确称取132 mg植酸钠，将其溶解于100 mL醋酸缓冲液中。MD培养基:1.34%YNB、2%葡萄糖、4×10-5生物素、1.5%琼脂粉。BMGY培养基:2%蛋白胨、1%酵母提取物、1.34%YNB、1%甘油、4×10-5生物素。BMMY培养基:2%蛋白胨、1%酵母提取物、1.34%YNB、0.5%甲醇、4×10-5生物素。

1.3 具有植酸酶活性的大肠杆菌的筛选

1.3.1 磷标准曲线的制作 分别精确量取2、3、4、5和6 mL磷标准储备液，放入100 mL容量瓶中,制成磷浓度为0.05、0.10、0.15、0.20和0.25 mmol/L的磷标准稀释梯度溶液。取6个灭菌的5 mL离心管，分别加入磷标准稀释梯度溶液1 mL和AMES显色液1 mL(如表1所示),在50 ℃水浴20 min后冷却至室温，测定在820 nm处的吸光度值(OD值)。以磷浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制OD-磷浓度标准曲线。

表1 OD-磷浓度标准曲线制作的设计

1.3.2 大肠杆菌发酵液植酸酶活性的测定 取适量新鲜猪粪便，加入无菌双蒸水后摇匀,将其稀释适当倍数后取50 μL涂布于多个LB固体培养基平板,37 ℃过夜倒置培养；挑取单菌落接种于LB液体培养基并分别编号,在37 ℃下以220 r/min的转速培养；离心收集菌体后加500 μL溶液Ⅰ悬浮并加入少量溶菌酶,在37 ℃下保温10 min后于冰上超声波破碎,适当稀释后检测植酸酶的活性,保留相对酶活最高的菌株备用。

取上述稀释后的处理液100 μL，加入反应液900 μL(对照组为1 mL醋酸缓冲液),30 ℃水浴反应30 min后加入1 mL 15%TCA终止液,以12000 r/min离心1 min；取上清100 μL,加入900 μL醋酸缓冲液、1 mL AMES显色液,50 ℃水浴20 min,冷却至室温后测定820 nm处的吸光度。酶活性计算公式为U=(OD-OD0)×N/(K×T),式中U为酶活性(μmol/min);OD为测定样品的吸光度;OD0为对照样品的吸光度;N为稀释倍数;K为标准曲线的斜率;T为反应时间(min)。将在37 ℃、pH 5.50条件下,每分钟从浓度为5.0 mmol/L植酸钠溶液中释放出l μmol无机磷所需要的植酸酶量定义为一个酶活单位。

1.4 植酸酶appA基因的克隆

根据GenBank上已公布的L03371[11]、AY496073[12]等序列的开放阅读框来进行引物的设计,上游添加XbaⅠ，下游添加EcoRⅠ酶切位点用于表达载体的构建。appA-F引物序列:5′-CCGTCTAGAATGAAAGCGATCTTAATCCCA-3′。appA-R引物序列:5′-GCGAATTCTTAgtgatggtgatggtgatgCAAACTGCACGCCGGTATGCG-3′。其中单下划线碱基为酶切位点,小写字母碱基为组氨酸(His)标签。

用高保真Pfu DNA聚合酶以相对植酸酶活性最高的大肠杆菌的基因组DNA为模板进行扩增,按照说明书添加相应的引物、模板等反应体系组分,反应参数如下:94 ℃ 4 min,94 ℃ 30 s,52 ℃ 45 s,72 ℃ 1.5 min,循环32次；72 ℃ 10 min,13 ℃保存。电泳鉴定后回收扩增产物并克隆到pMD19-T载体,送到南京金思特科技有限公司测序,并对测序结果进行生物信息学分析。

1.5 植酸酶appA基因在毕赤酵母中的表达

利用Plasmid Mini Kit I试剂盒，参照说明书分别提取测序正确的pMD19-appA质粒和pPIC9K质粒,然后用XbaⅠ和EcoRⅠ限制性内切酶分别对这两个质粒进行双酶切反应,利用Gel Extraction Kit试剂盒回收相应的目的片段并进行连接，构建pPIC9K-appA表达载体,将构建好的载体送到南京金思特科技有限公司进行测序验证。利用试剂盒大量提取pPIC9K-appA表达载体,用SacI限制性内切酶对表达载体进行线性化；然后参照文献[13]制备毕赤酵母GS115感受态细胞，电击转化线性化后的表达载体,进行His+阳性转化子的筛选,利用G418进行高拷贝appA酵母菌株的筛选；最后参照文献对筛选出的菌株进行甲醇诱导，使其大量表达植酸酶,利用组氨酸标签进行目的蛋白的纯化。

1.6 表达产物部分酶学性质的分析

将纯化的重组appA植酸酶首先在37 ℃、不同pH下进行酶促反应,底物1 mmol/L植酸钠用不同pH缓冲液配制。其中pH 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0为甘氨酸-盐酸缓冲液体系; pH 3.5、4.0、4.5、5.0、5.5为醋酸-醋酸钠缓冲液体系; pH 6.0、6.5为咪唑-盐酸缓冲液体系; pH 7.0、7.5、8.0为Tris-盐酸缓冲液体系。最适反应温度实验：在pH 5.0下,分别在25、37、40、45、50、55、60、65、70、80、90 ℃下进行酶促反应。将在某条件下酶活占最高酶活(100%)的百分数定义为该酶在此条件下的相对酶活。

2 结果与分析

2.1 高活性植酸酶appA大肠杆菌菌株的筛选

将采集的饲喂青饲料的猪的新鲜粪便进行稀释涂板后过夜培养,共挑取了59个单菌落进行过夜培养,对扩大培养的菌体进行处理后采用维生素C-钼蓝法测定植酸酶的相对比活性。结果发现不同菌落之间的相对酶活性相差较大,其中编号18的菌株的相对酶活性最高，达271.31 μmol/min(见表2)。因此保留植酸酶相对活性最高的菌株18，作进一步研究。

表2 从猪粪便中筛选的菌株及其植酸酶活性测定结果

2.2 植酸酶appA基因的克隆

以相对植酸酶活性最高的菌株18的基因组DNA为模板进行PCR扩增,电泳检测到大约1400 bp的特异性扩增条带(如图1所示)。将其克隆至pMD19-T载体，然后进行XbaI和EcoRI双酶切鉴定，最后进行测序,测序结果如图2所示,其中进行序列分析时除去了两边测序载体的序列。

图1 PCR扩增产物检测结果

将测序结果在NCBI上进行Blast分析,结果表明,该序列与Dassa J等[11]公布的appA基因序列(GeneBank:L03371)同源性较高,仅有3个核苷酸发生突变,分别在起始密码子后面的第67位、114位和215位,由公布序列的谷氨酰胺(Gln)转变为精氨酸(Arg),天冬氨酸(Asn)转变为组氨酸(His),第215位公布的序列为未知碱基(如图2)。该扩增产物包含完整的开放阅读框,appA基因全长1296 bp,编码432个氨基酸；在线预测(http://www.expasy.org/tools/)该蛋白质的分子量为47.10 kDa,等电点pI为6.93。该序列具备组氨酸酸性磷酸酶的活性中心RHGxRxP(x代表任意氨基酸)保守序列和催化中心HD保守序列[14],说明可以将该appA植酸酶归为组氨酸酸性磷酸酶这一家族；另外在氨基酸第161～163位点、226～228位点和339～340位点分别存在3个潜在的糖基化位点。

波浪线下划线部分为限制性酶切位点;双下划线部分为保守序列;单下划线部分为催化中心保守序列;虚下划线部分为组氨酸标签。

2.3 植酸酶appA基因的酵母表达

目前有不少的研究报道已经表明appA基因通过原核表达系统能够进行诱导表达且能检测到植酸酶活性,由于该基因是在大肠杆菌中克隆获得的,因此大肠杆菌表达系统对该基因的翻译表达修饰等更具有优势,但是要将该基因转化入真核生物以降低植酸及其螯合物对动物饲料及环境污染的影响,就需要对该基因在真核表达系统中的表达进行研究。因此本研究将该基因克隆至真核表达载体pPIC9K中进行巴斯德毕赤酵母的诱导表达,通过在外源蛋白的N-末端融合6个组氨酸串联的His-tag,有利于对表达的目的蛋白进行纯化进而检测其酶活性及部分酶学性质分析。

经过MD平板筛选后获得表型为His+和Mut+的转化子；经3次继代培养后进行PCR阳性鉴定和G418平板筛选,获得1株具有高拷贝数的植酸酶appA基因工程菌菌株；经甲醇诱导表达,分别收集0、24、48、72、96 h时间点的表达上清液,进行SDS-PAGE凝胶电泳分析,如图3a所示,诱导24 h时菌株表达量开始增加,随着诱导时间的增加其表达的蛋白量也增加,在分子量约55 kDa处表现出特征性条带；然后利用组氨酸His-tag对诱导表达的蛋白进行了纯化,如图3b所示,表现为单一的条带,说明纯化的蛋白比较单一,可以用于后续部分酶学性质的分析研究。

a:甲醇诱导的表达蛋白;1:对照毕赤酵母;2:诱导0 h;3:诱导24 h;4:诱导48 h;5:诱导72 h;6:诱导96 h;M:低分子量蛋白质Marker。b:纯化的诱导表达蛋白;M:低分子量蛋白质Marker;1、2、3:纯化的目的蛋白。

图3重组酵母工程菌表达蛋白及纯化蛋白的SDS-PAGE分析结果

2.4 表达蛋白的部分酶学性质分析

在37 ℃条件下测定了经Ni亲和柱纯化的appA植酸酶在不同pH值条件下的相对酶活性,结果显示该纯化的重组appA植酸酶最适pH为5.0,并且在pH 2.5时有1个次高峰。这与陈寅等[15]报道的结果相似。当pH值超过6.0时,其相对酶活性迅速下降,如图4。在pH 5.0条件下分别测定了25～80 ℃下酶促反应的相对酶活力,结果显示重组appA植酸酶相对酶活性在25～55 ℃之间随温度的上升而增强,至55 ℃时达最大；此后随温度的继续上升而逐渐降低,当温度达到80 ℃后酶活基本丧失,如图5。

图4 重组appA植酸酶的最适pH值

3 讨论和结论

磷是动物、植物及人类生长发育必需的元素之一,并且在生物体代谢过程中起着重要的作用。一方面磷缺乏日趋严重,另一方面植物性饲料中的磷有2/3为植酸磷,单胃动物无法对其消化吸收而造成磷污染,同时植酸及其螯合物还会影响动物体对营养元素及蛋白质等的吸收利用,从而增加养殖业的成本,因此植酸酶的出现就很好地解决了此类问题。植酸酶的研究已有100多年的历史,目前来源于大肠杆菌的appA植酸酶分解植酸及其螯合物的能力最强[16]。本研究在饲喂青饲料为主的猪的粪便中进行大肠杆菌的培养,采用维生素C-钼蓝法测定植酸酶活性,选择相对活性最高的菌株,提取基因组并从中克隆获得植酸酶appA基因,与已报道的appA基因同源性较高,仅有3个碱基位点发生了突变,具有组氨酸酸性磷酸酶家族活性中心位点RHGxRxP(x代表任意氨基酸)保守序列和催化中心HD保守序列；然后将其克隆至pPIC9K表达载体,并电击转化入毕赤酵母，经甲醇诱导表达获得55 kDa左右的蛋白；预测该植酸酶appA存在3个潜在的N-端氨基酸糖基化位点,而N-端糖基化修饰会导致蛋白质大于其预测分子量[17]。对于载体的线性化，采用BglⅡ[18]、AvrⅡ[19]和DraⅠ[20]等限制性内切酶处理会影响表达单元整合的方式及拷贝数，进而影响获得基因高效表达菌株[21],而采用SacI线性化的研究较少,但利用此酶亦能获得高表达的重组子。

图5 重组appA植酸酶的最适反应温度

植酸酶活性测定的方法较多但没有统一的标准,其中钒-钼酸铵法的灵敏度最高，而维生素C-钼蓝法次之。在进行无机磷含量测定时，如果灵敏度要求过高，则必须满足试剂纯度高、水的纯度高和玻璃仪器的清洁程度高的要求,还要对样品进行高度稀释,这就会增加测定过程的繁琐度，因而精度相对会降低[22]。有研究表明三氯乙酸(TCA)在37 ℃下可部分水解植酸钠[22],但是本研究是在酶促反应达到一定时间后才采用TCA使酶失活,并且在终止酶促反应后立即进行显色，这样可以防止TCA对底物的作用,因此检测的酶活力结果更准确。

大肠杆菌表达系统较成熟完善,其优点为繁殖速度快、培养条件简单、操作过程方便、遗传比较稳定,因此大肠杆菌被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物。但是大肠杆菌表达系统缺乏对蛋白质的修饰加工且细胞周质内含有种类繁多的内毒素等。而甲醇酵母表达系统能克服大肠杆菌表达系统的不足,可以进行蛋白质翻译后的修饰和加工,能分泌目的蛋白到培养液中，有利于纯化,但受启动子的严格调控分泌效率较低。Stahl等[23]将appA植酸酶基因在酵母中诱导表达，其植酸酶活力达到了117 U/mL；黄光瑞等[24]构建appA重组菌株进行酵母表达，诱导168 h后酶活力达到了422 U/mL；而本研究在表达96 h后其上清液的酶活力能达到368 U/mL。同时利用Ni亲和柱进行纯化的浓度较低,效率较差,还需要对表达条件及蛋白的纯化等环节进行进一步的优化。

[1] Purva V, Uttam C B. Production studies and catalytic properties of phytases (myo-inositol hexakis phosphate phosphohydrolases): an overview [J]. Enzyme Microb Technol, 2004, 35: 3-14.

[2] Cao L, Diana J. Application of microbial phytase in fish feed [J]. Enzyme Microb Technol, 2007, 40: 497-507.

[3] Afnah S, Yazid A M. Phytase: application in food industry [J]. Int Food Res J, 2010, 17: 13-21.

[4] Mallin M A. Impacts of industrial animal production on rivers and estuaries [J]. Am Sci, 2000, 88: 26-37.

[5] Nelson T S, Shieh T R. The availability of phytate phosphorous in soybean before and after treatment with a mold phytase [J]. Poultry Sci, 1968, 47(6): 1842-1848.

[6] 马恒甲,叶金云,郭建林,等.饲料中添加植酸酶对草鱼生长、体组成及各组织磷含量的影响[J].上海海洋大学学报,2011,20(6):845-852.

[7] 梁欣,于晓丽.植酸酶在家禽饲料中应用的研究进展[J].山东畜牧兽医,2012,33(4):81-83.

[8] 刘晋生,邓俊良,牛一兵,等.转基因植酸酶玉米主要营养成分及其猪消化率的测定[J].中国饲料,2012,14:10-18.

[9] Golovan S, Wang G, Zhang J, et al. Characterization and overproduction of theEscherichiacoliappA encoded bifunctional enzyme that exhibits both phytase and phosphatase activities [J]. Can J Microbiol, 2000, 46: 59-71.

[10] Lei X G, Porres J M. Phytase: source, structure and application [J]. Industrial Enzymes, 2007, 505-529.

[11] Dassa J, Marck C, Boquet P L. The complete nucleotide sequence of theEscherichiacoligeneappA reveals significant homology between pH 2.5 acid phosphatase and glucose-1-phosphatase [J]. J Bacteriol, 1990, 172(9): 5497-5500.

[12] Rodriguez E, Han Y, Lei X G. Cloning, sequencing, and expression of anEscherichiacoliacid phosphatase/phytase gene (appA2) isolated from pig colon [J]. Biochem Biophys Res Commun, 1999, 257(1): 117-123.

[13] 李镇刚.中性植酸酶基因克隆表达、功能分析及对桑树遗传转化的研究[D].重庆:西南大学,2012.

[14] Rudy J, Wodzinski A H, Ullah J. Phytase [J]. Advances in Applied Microbiology, 1996, 42: 263-302.

[15] 陈寅,朱中泽,张志芳,等.大肠杆菌植酸酶基因appA的克隆与高效表达[J].微生物学通报,2004,31(3):74-78.

[16] Lei X G, Stahl C H. Biotechnological development of effective phytases for mineral nutrition and environmental protection [J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2001, 57: 474-481.

[17] Luo H Y, Huang H Q, Yang P L, et al. A novel phytaseappAfromCitrobacteramalonaticusCGMCC 1696: gene cloning and overexpression inPichiapastoris[J]. Curr Microbiol, 2007, 55: 185-192.

[18] 王红宁,马孟根,吴琦,等.黑曲霉N25植酸酶phyA基因在巴斯德毕赤酵母中高效表达的研究[J].菌物系统,2001,20(4):486-493.

[19] 罗会颖,黄火清,柏映国,等.增加植酸酶基因appA-m的拷贝提高其在巴斯德毕赤酵母的表达量[J].生物工程学报,2006,22(4):528-533.

[20] 李健,彭远义.毕赤酵母Mut+和MutS重组子表达植酸酶基因及其表达物的酶学性质比较[J].生物技术通报,2006(3):58-62.

[21] Vassileva A, Arora C D, Swaminathan S, et al. Effect of copy number on the expression levels of hepatitis B surface antigen in the methylotrophic yeastPichiapastoris[J]. Protein Espr Purif, 2001, 21(1): 71-80.

[22] 张若寒.植酸酶活性的检测方法[J].中国饲料,1997(5):30-32.

[23] Stahl C H, Wilson D B, Lei X G. Comparison of extracellularEscherichiacoliAppA phytases expressed inStreptomyceslividansandPichiapastoris[J]. Biotechnol Lett, 2003, 25(10): 827-831.

[24] 黄光瑞,田丽春,黄生平,等.密码子优化的植酸酶基因appA-P在毕赤酵母中的高效表达[J].湖北大学学报,2007,39(3):290-293.

Cloning,ExpressionandPropertiesofPhytaseappAGeneinEscherichiacoli

RAN Rui-fa, LIU Shu-juan, XIAO Sheng-yan, FENG Wei, LI Zhen-gang*

(Sericulture & Apiculture Research Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Mengzi 661101, China)

Through adopting vitamin C-molybdenum blue method, we isolated and screened out anEscherichiacolistrain which could produce high-activity appA phytase from the excrement of swine feeding on green fodder. The phytaseappAgene was cloned from the genome of this strain by using PCR method. The sequencing results showed that the overall length of this PCR product was 1447 bp, and in the coding region of this phytase gene there were 1296 nucleotides encoding 432 amino acids. This coding region was cloned into pPIC9K vector, and then the pPIC9K-appA was transformed intoPichiapastoristo induce the expression ofappAgene by methanol. A characteristic band of about 55 kDa was obtained, and the enzyme activity of the supernatant reached 368 U/mL after 96-h expression. The target protein was purified by Ni affinity column, and the analysis of partial enzymatic properties indicated that: the optimum reaction temperature for recombinant appA phytase was 55 ℃, and the enzyme activity decreased obviously when the temperature was higher than 60 ℃; the optimum pH-value for this enzyme was 5.0.

Phytase;appAgene;Escherichiacoli; Cloning; Expression;Pichiapastoris

2017-07-12

国家自然科学基金项目(31360190)。

冉瑞法(1976─),男,助理研究员,主要从事桑树资源搜集与遗传育种研究。*通讯作者:李镇刚。

Q78

A

1001-8581(2017)11-0001-06

(责任编辑:黄荣华)