Hca-F抗原-HSP70BCG疫苗免疫对小鼠肝癌Hca-F的免疫保护效应

郭连英 张 婷 黄 琳 张 雪 刘花丽 于向洋 王慧娟 高瑞芳 李发胜 曹 靖

(大连医科大学病理学与病理生理学，辽宁 大连 116044)

1 大连医科大学麻醉学院

Hca-F抗原-HSP70BCG疫苗免疫对小鼠肝癌Hca-F的免疫保护效应

郭连英 张 婷 黄 琳 张 雪1刘花丽1于向洋1王慧娟1高瑞芳1李发胜 曹 靖

(大连医科大学病理学与病理生理学，辽宁 大连 116044)

目的探讨化学交联法构建的Hca-F抗原-卡介苗热休克蛋白70(HSP70BCG)复合物对Hca-F肝癌的主动免疫保护效应及其机制。方法采用ADP亲和层析方法提取HSP70BCG，超速离心法提取粗制肿瘤抗原，采用化学连接法或加入ADP构建Hca-F抗原-HSP70BCG复合物，免疫正常小鼠，3次后检测对Hca-F攻击的主动免疫保化效应，用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测Hca-F刺激下的脾细胞增殖反应，用流式细胞仪检测脾细胞表型的变化。结果化学交联法和加入ADP构建的Hca-F抗原-HSP70BCG复合物免疫可延长小鼠的存活时间，增强脾细胞对抗原刺激的应答能力和细胞介导的细胞毒活性、提高γδT细胞的百分率。结论Hca-F抗原-HSP70BCG复合物免疫可诱导抗瘤免疫保护效应。

肿瘤疫苗；卡介苗；热休克蛋白；免疫保护效应

热休克蛋白(HSPs)表达增加能增加细胞对有害刺激的抵抗能力，是存在于从原核细胞到真核细胞的一种普遍的共同防御机制〔1〕。HSPs-肽复合物还具有提呈抗原等免疫学作用〔2〕。从肿瘤细胞中提取的HSPs-肽复合物具有肿瘤特异性抗原的作用，可诱导较强的抗肿瘤免疫应答，从肿瘤细胞中提取的HSPs-肽复合物作为肿瘤疫苗的可能性日益受到重视。但肿瘤细胞中具有肿瘤抗原作用的HSPs-肽复合物量少，而手术切除的肿瘤组织量也不可能很多，从病人自体肿瘤提取HSPs-肽复合物作为肿瘤疫苗严重受限。本研究探讨Hca-F抗原卡介苗热休克蛋白(HSP70BCG)免疫对小鼠肝癌Hca-F的免疫保护效应及其作用机制。

1 材料和方法

1.1实验动物与瘤株 Balb/c小鼠(H-2d)，8～12周龄，体重20～24 g，雌雄各半。L929(H-2k)为小鼠成纤维瘤细胞系，由中国医学科学院肿瘤研究所张友会教授惠赠，Hca-F为小鼠腹水型肝癌H22(H-2)的高淋巴道转移亚系，由本校病理学教研室凌茂英教授惠赠。

1.2主要药品与仪器 噻唑蓝(MTT，Fluca，瑞士)，异硫氰酸荧光素(FITC)大鼠抗小鼠CD4、CD8a单克隆抗体和FITC-羊抗小鼠γδ单克隆抗体(Pharmingen，USA)，多孔酶标测定仪(Clin-Bio 120c)，流式细胞仪(Coulter Epics XL，USA)。

1.3Hca-F抗原-HSP70BCG疫苗制备 无菌取Hca-F腹水，低渗法破坏红细胞离心制成瘤细胞悬液，调细胞浓度至1×108/ml，用电动匀浆器研磨制成细胞匀浆，100 000 r/min离心取上清组分作为粗制肿瘤抗原。超声碎BCG菌、超速离心后取上清，用ADP亲和层析法〔3〕分离HSP70 BCG，提取物经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳鉴定。分别用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量后调整到所需浓度后，按比例将两类成分混合，加入化学交连剂或ADP使之相互作用形成结(复)合物用于实验中。

1.4体内Hca-F抗原-HSP70BCG疫苗免疫 健康Balb/C小鼠随机分成五组，分别于第0、7、14天皮下注射磷酸盐缓冲液(PBS)、Hca-F溶解物、HSP70BCG、Hca-F 抗原-HSP70BCG(CL)和Hca-F 抗原-HSP70BCG(ADP)，末次免疫后10 d用有活性Hca-F细胞(2×106/ml/只)攻击，观察小鼠存活时间，观察60 d；或腹腔注射多聚甲醛固定的Hca-F细胞，3 d后活杀小鼠，取脾细胞测定增殖活性、细胞毒活性和细胞表型。

1.5细胞增殖与细胞毒性试验 均采用MTT法。无菌取小鼠脾脏制备脾细胞悬液，低渗法破红细胞后调细胞浓度至4×106/ml，取100 μl加入96孔细胞培养板(CORNING，USA)。细胞增殖试验时向96孔板中加入Hca-F溶解物、HSP70BCG、Hca-F抗原-HSP70BCG(CL)和Hca-F抗原-HSP70BCG(ADP)，对照孔中加入1640全培基，ConA作为阳性对照，5% CO2、37℃培养72 h；细胞毒试验时向96孔培养板中加入Hca-F或L929细胞，每孔100 μl，浓度为2×105/ml，培养24 h，培养结束前4 h加MTT(5 μg/ml)20 μl，于570 nm测光密度值。

1.6细胞表型测定 取小鼠脾细胞1×106个，加入FITC标记的单抗，4℃温育20 min，用PBS洗3次后用染色固定液固定后，流式细胞仪测定。

1.7统计学处理 应用SPSS16.0软件行方差分析和t检验。

2 结 果

2.1Hca-F 抗原-HSP70BCG免疫对Hca-F的免疫保护效应 与攻击对照组〔(25.9±4.2)d〕相比，单用Hca-F溶解物免疫并不能延长小鼠的存活时间〔(26.5±4.6)d〕，HSP70BCG免疫小鼠存活时间〔(39.3±4.6)d〕有所延长，但无1只小鼠能长期存活，用两种Hca-F 抗原-HSP70BCG免疫的小鼠分别有3/8和2/8长期存活，平均存活时间〔(36.3±3.3)d，(29.5±2.8)d〕也有所延长。

2.2体内预刺激小鼠脾细胞对体外Hca-F抗原-HSP70BCG再刺激的增殖反应 Hca-F抗原-HSP70BCG免疫小鼠脾细胞不仅对体内免疫物再刺激发生增殖反应,对多聚甲醛固定的Hca-F(PF fixed Hca-F)的再刺激也发生了较强的增殖反应。见表1。

2.3免疫小鼠的脾细胞介导的细胞毒作用 HSP70BCG、Hca-F抗原-HSP70BCG(化) Hca-F抗原-HSP70BCG(ADP)免疫小鼠的脾细胞对Hca-F和L929两种靶细胞的细胞毒活性都增强，与注射PBS的对照小鼠脾细胞相比差别有统计学意义(P<0.05 或P<0.01)。见表2。

2.4免疫小鼠脾细胞表型的变化 注射PBS的对照小鼠和Hca-F 溶解物免疫的小鼠脾细胞中γδT的百分率比较低，HSP70BCG 免疫后γδT细胞百分率增加，Hca-F抗原-HSP70BCG(CL)和 Hca-F抗原-HSP70BCG(ADP)免疫后γδT 细胞百分率也增加，而CD4和 CD8a百分率变化不大。见表3。

表1 小鼠脾细胞对刺激的免疫增殖反应(OD750值)

与对照组比较：1)P<0.05，P<0.01；下表同

表2 小鼠脾细胞介导的细胞毒性

表3 小鼠脾细胞表型的变化(%)

3 讨 论

本实验的结果表明，用Hca-F抗原-HSP70BCG(CL)和Hca-F抗原-HSP70BCG(ADP)免疫正常小鼠，对Hca-F的攻击有较明显的主动免疫保护效应，优于 HSP70BCG 和Hca-F 溶解物(含肿瘤抗原)单用的效果，提示将肿瘤抗原与HSP70BCG连接形成复/结合物可用做肿瘤疫苗用于肿瘤的主动特异性免疫治疗；向反应体系中加入化学连接剂使肿瘤抗原和HSP70BCG通过共价键或其他力连接形成结合物(Tumor antigens-HSP70BCG conjugates)，或者根据热休克蛋白与蛋白质/多肽结合与解离的特性(如向反应体系中加ADP)制备肿瘤抗原-HSP70BCG复合物(Tumor antigens-HSP70BCG complexes)都是可行的办法〔4〕。

癌症患者针对自身癌细胞的T细胞已经鉴定出许多肿瘤抗原。其中有些肿瘤抗原表位已被用于制备肿瘤疫苗或用于冲激树突细胞(DC)制备DC肿瘤疫苗〔5〕，但上述肿瘤抗原中大多数都是通过T细胞受体(TCR)-MHC/抗原肽三元体相互作用机制启动免疫应答的，TCR、MHC分子的高度多肽性将限制这些肿瘤抗原的应用肿瘤抗原免疫原性弱和(或)机体对它们的免疫耐受等也影响肿瘤抗原的免疫效果〔6〕。HSPS是一组进化上高度保守的蛋白质，HSPs-肽复合物可通过多种机制与免疫系统相互作用，在细胞内HSPs携带抗原肽到内质网与MHC分子装配形成MHC-抗原肽复合物，外源性也有多种免疫学作用，HSPs是病原微生物的重要抗原之一，可为宿主免疫系统所识别，如γδT细胞可识别感染后产生或表达于受感染细胞表面的HSPs〔7〕。HSP96与不成熟DC表面的CD91结合诱导其活化与成熟，可能成为一种较为有用的抗原表位携带体〔8〕。BCG早已广泛用于结核病〔9〕的预防和肿瘤〔10〕的非特异性免疫治疗，因而优于其他微生物来源的HSPS。本实验的结果表明HSP70BCG与肿瘤抗原形成结(复)合物后不论是主动免疫保护效应还是诱导脾细胞活化和介导细胞毒作用都有所增强，γδT细胞百分率增加，提示HSP70BCG具有抗原载体和佐剂的作用，可用于制备肿瘤抗原疫。

1Lindquist S.The heat-shock response〔J〕.Annu Rev Biochem,1986;55:1151-91.

2Wang YS,Liu SJ,Huang SC.Recombinant heat shock protein 70 in combination with radiotherapy as a source of tumor antigens to improve dendritic cell immunotherapy〔J〕.Front Oncol,2012;2(2):149.

3Murshid A,Gong J,Calderwood SK.Purification,preparation,and use of chaperone-peptide complexes for tumor immunotherapy〔J〕.Methods Mol Biol,2013;960(2):209-17.

4Dong L,Zhang X,Ren J,etal.Human prostate stem cell antigen and HSP70 fusion protein vaccine inhibits prostate stem cell antigen-expressing tumor growth in mice〔J〕.Cancer Biother Radiopharm,2013;28(5):391-7.

5Sreedhar AS.HSP70 confines tumor progression of rat histiocytoma and impedes the cytotoxicity induced by natural killer cells and peritoneal macrophages 〔J〕.Asian Pacific J Tropical Med,2010;3(4):302-9.

6Cao W,He W.The recognition pattern of gamma delta T cells〔J〕.Front Biosci,2005;10:2676-700.

7Hirsh MI,Junger WG.Roles of heat shock proteins and gamma delta T cells in inflammation〔J〕.Am J Respir Cell Mol Biol,2008;39(5):509-13.

8Zhou YJ,Binder RJ.The heat shock protein-CD91 pathway mediates tumor immunosurveillance 〔J〕.Oncoimmunology,2014;3:e28222.

9World Health Organization.BCG vaccine.WHO position paper〔J〕.Wkly Epidemiol Rec,2004;79(4):27-38.

10Wainberg MA,Deutsch V,Weiss DW.Stimulation of anti-tumour immunity in guinea-pigs by methanol extraction residue of BCG〔J〕.Br J Cancer,1976;34(5):500-8.

国家质检总局基金(2013K228)

曹 靖(1963-)，女，硕士，副教授，主要从事抗肿瘤研究。

郭连英(1962-)，女，实验师，主要从事肿瘤生物治疗研究。

R392.9

A

1005-9202(2017)20-4995-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.20.017

〔2017-03-11修回〕

(编辑 袁左鸣)