磷脂酰肌醇-3-激酶/丝-苏氨酸蛋白激酶在帕妥珠单抗耐药机制中的作用

苏坤华

(三峡大学第一临床医学院 宜昌市中心人民医院药剂科，湖北 宜昌 443000)

磷脂酰肌醇-3-激酶/丝-苏氨酸蛋白激酶在帕妥珠单抗耐药机制中的作用

苏坤华

(三峡大学第一临床医学院 宜昌市中心人民医院药剂科，湖北 宜昌 443000)

目的探讨磷脂酰肌醇-3-激酶/丝-苏氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)在帕妥珠单抗耐药机制中的作用。方法建立人乳腺癌细胞株Hs578T耐帕妥珠单抗的耐药亚株Hs-Her，(FISH)法分析耐药细胞株Her表型；MTT法检测帕妥珠单抗对Hs578T和Hs-Her细胞增殖的抑制情况；流式细胞术检测帕妥珠单抗干预后细胞凋亡情况；PI3K/Akt抑制剂干预细胞后Western印迹检测细胞P-Akt蛋白表达情况。结果本实验建立的耐药亚株Hs-Her基因表达FISH检测呈强阳性；0.1～100 mg/L浓度帕妥珠单抗干预72 h后，Hs578T和Hs-Her细胞体外增殖均受到抑制，且随帕妥珠单抗浓度的增加而提升，其中Hs578T的IC50值明显低于Hs-Her(P<0.01)；10 mg/L的帕妥珠单抗干预后Hs578T细胞凋亡率明显高于Hs-Her细胞(P<0.01)。预先经PI3K/Akt抑制剂处理后再加入帕妥珠单抗，Hs578T和Hs-Her细胞均发生明显凋亡，差异无统计学意义(P>0.05)。Western印迹检测显示，帕妥珠单抗可有效抑制Hs578T细胞Akt蛋白磷酸化，却无法抑制Hs-Her细胞Akt蛋白磷酸化；PI3K/Akt信号通路抑制剂可同时抑制Hs578T和Hs-Her细胞的Akt蛋白磷酸化。结论帕妥珠单抗耐药细胞Hs-Her存在Akt蛋白磷酸化，PI3K/Akt抑制剂可明显抑制帕妥珠单抗耐药细胞Akt蛋白磷酸化；PI3K/Akt信号通路与帕妥珠单抗耐药性存在明确相关性。

帕妥珠单抗；磷脂酰肌醇-3-激酶丝苏氨酸蛋白激酶；人乳腺癌细胞；耐药

乳腺癌是中老年女性常见恶性肿瘤之一，发病率逐年上升。Her基因编码跨膜受体型酪氨酸蛋白激酶在乳腺癌中过表达率>30%，且与保守治疗低敏感性和不良预后密切相关〔1〕。帕妥珠单抗已逐渐成为治疗Her基因阳性晚期乳腺癌的一线药物，但仍有近半数的Her基因阳性患者对帕妥珠单抗敏感性差，多数患者给予帕妥珠单抗治疗1年后会产生耐药性〔2〕。帕妥珠单抗的耐药机制复杂；相关研究显示，磷脂酰肌醇-3-激酶/丝-苏氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)信号通路激活是其耐药的主要机制之一〔3〕。本研究旨在探讨帕妥珠单抗的耐药机制。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 人乳腺癌细胞株Hs578T购于上海拜力生物科技有限公司；帕妥珠单抗购于美国罗氏制药公司。DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购于上海哈灵生物科技有限公司；双染法细胞凋亡检测试剂盒购于北京诺博莱德科技有限公司；兔抗人磷酸化蛋白激酶B抗体、PI3K/Akt抑制剂、兔抗人β-actin抗体购于上海万疆生物技术有限公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG、原位杂交试剂盒购于上海拜力生物科技有限公司。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养和耐药细胞株建立 常规贴壁法培养Hs578T细胞，培养基为含10%胎牛血清的DMEM，置于37℃ 5%CO2培养箱中孵育，0.25%胰蛋白酶消化传代。按Narayan等〔4〕方法对Hs578T细胞连续处理6个月，建立耐帕妥珠单的耐药亚株Hs-Her，从浓度为1 mg/L的帕妥珠单抗起，连续培养至可在帕妥珠单抗中稳定生长，细胞形态与亲代基本一致，之后逐渐提升培养液中帕妥珠单抗浓度到10 mg/L。每5 d换液1次；观察细胞密度>70%时传代，MTT法鉴定耐药程度。

1.2.2FISH法分析耐药细胞株Her表型 消化细胞配成密度为1×107/L的细胞悬液，取10 ml，2 000 r/min离心20 min，弃去上清。滴加浓度为0.56%的KCl溶液10 ml，吹打重悬细胞，水浴孵育30 min。滴加2 ml固定液，2 000 r/min离心20 min，弃上清至留下1 ml，加5 ml固定液重悬细胞，离心后留下1 ml，重悬后滴于玻片表面；自然晾干后在杂交区域滴加5 μl探针，封片后放入全自动杂交仪中过夜；拿去盖玻片，洗涤后放入70%乙醇中浸泡5 min，暗处晾干；每张切片表面滴加10 μl DAPI，荧光显微镜下通过滤波片观察，计数50个细胞，计算Ratio值。FISH荧光原位杂交检测试剂盒包含两种DNA探针：GLP Her和CSP17，其中Her探针荧光信号为橘红色，CSP17为蓝绿色，两种信号的比值可用来判断是否存在Her基因扩增。Ratio<1.8为阴性，无Her基因扩增；>2.2为阳性，存在Her基因扩增；在1.8～2.2之间时增加细胞计数重新判断结果。

1.2.3细胞增殖抑制检测 取对数期细胞，按1×107/L密度接种到96孔板中，培养24 h后滴加不同浓度的帕妥珠单抗，同时设置阴性对照，常规孵育72 h，往各细胞培养孔中加入10 μl浓度为10 g/L的MTT，继续培养6 h后终止反应，滴加100 μl的二甲基亚砜(DMSO)，振荡15 min，放入酶标仪中读取450 nm处的吸光度值，计算细胞增殖抑制率。

1.2.4细胞凋亡检测 不同浓度帕妥珠单抗处理细胞，预先使用10 μmol/L的PI3K/Akt信号通路抑制剂处理细胞6 h后，再用10 mg/L的帕妥珠单抗共同处理细胞。收集贴壁和悬浮的细胞，2 000 r/min离心10 min，磷酸缓冲液洗涤细胞后计数；结合缓冲液重悬细胞，调整浓度至1×108/L，将200 μl细胞悬液转入5 ml流式管中，滴加Annexin V 和PI各5 μl，混合均匀后避光静置5 min，流式细胞仪检测，计算早期细胞凋亡率。

1.2.5Western印迹检测细胞P-Akt蛋白表达 分别用帕妥珠单抗和PI3K/Akt信号通路抑制剂处理578T细胞和耐药亚株Hs-Her细胞，培养24 h，加入细胞裂解静置30 min，4℃ 12 000 r/min离心30 min，取上清；行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，湿法转移至聚偏氧乙烯(PVDF)膜，室温封闭3 h，滴加兔抗人磷酸化蛋白激酶B抗体(1∶500)，孵育过夜，滴加二抗，室温孵育2 h，凝胶成像系统扫描并分析条带中的灰度值。

1.3统计学分析 使用SPSS18.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1耐药亚株Hs-Her细胞的FISH检测情况 Hs578T细胞中Ratio为1.52，呈阴性，无Her基因扩增；Hs-Her细胞中Ratio为2.81，呈阳性，存在Her基因扩增。见图1。

2.2帕妥珠单抗对Hs578T和Hs-Her细胞增殖的抑制和凋亡情况 不同浓度帕妥珠单抗干预72 h后，Hs578T和Hs-Her细胞体外增殖均受到抑制，且随帕妥珠单抗浓度的增加而提升。帕妥珠单抗对Hs578T的IC50为1.447 mg/L，Hs-Her的IC50为34.015 mg/L，差异有统计学意义(P<0.01)。不同浓度Hs578T和Hs-Her细胞增殖抑制率之间差异均有统计学意义(P<0.01)，见表1。流式细胞仪检测显示，10 mg/L的帕妥珠单抗干预Hs578T和Hs-Her细胞后细胞凋亡率分别为25.69%±0.62%、7.05%±0.38%，差异有统计学意义(P<0.01)。

图1 Hs-Her细胞株对帕妥珠单抗耐药性的FISH检测结果

2.3PI3K/Akt抑制剂和帕妥珠单抗对细胞凋亡和P-Akt蛋白表达的影响 流式细胞仪检测显示，预先经PI3K/Akt抑制剂处理后再加入帕妥珠单抗，Hs578T和Hs-Her细胞均发生明显凋亡，分别为28.30%±4.35%、27.92%±2.71%，差异无统计学意义(P>0.05)。Western印迹检测显示，10 mg/L的帕妥珠单抗可有效抑制Hs578T细胞Akt蛋白磷酸化，却无法抑制Hs-Her细胞Akt蛋白磷酸化，10 μmol/L的PI3K/Akt信号通路抑制剂可同时抑制Hs578T和Hs-Her细胞的Akt蛋白磷酸化。见图2。

表1 不同浓度帕妥珠单抗对Hs578T和Hs-Her细胞增殖抑制率的影响

与Hs578T比较：1)P<0.01

1：空白对照；2：10 mg/L的帕妥珠单抗处理24 h；3：10 μmol/L的PI3K/Akt抑制剂处理6 h；4：10 μmol/L的PI3K/Akt抑制剂处理6 h后再用10 mg/L的帕妥珠单抗处理24 h图2 PI3K/Akt抑制剂和帕妥珠单抗处理后Hs578T、Hs-Her中P-Akt蛋白表达情况

3 讨 论

PI3K/Akt信号通路在细胞增殖中发挥重要调控作用，可诱导细胞增殖、分化，抑制细胞凋亡，是细胞恶性生物学特征的主要发生机制之一〔5〕。帕妥珠单抗药效作用的一个重要机制未抑制Her-PI3K-Akt通路的传导，与Her结合后可抑制其磷酸化，感染PI3Kp85调节亚单位形成，抑制PI3K激活，进而下调细胞周期蛋白，诱导癌细胞凋亡〔6〕。但同时还存在表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子(IGF)-1等多种细胞因子可活化Akt，导致帕妥珠单抗耐药菌株可能存在Akt持续活化现象，是帕妥珠单抗耐药的可能原因之一〔7〕。

帕妥珠单抗耐药细胞Akt蛋白磷酸化活化，通过PI3K/Akt特异性抑制剂下调耐药细胞PI3K/Akt活性，证实了帕妥珠单抗抑制了Hs578T的Akt蛋白磷酸化，但无法抑制耐药亚株Hs-Her的Akt蛋白磷酸化。而PI3K/Akt特异性抑制剂可同时抑制Hs578T和Hs-Her细胞的Akt蛋白磷酸化。进一步阐明了PI3K/Akt特异性抑制剂下调该信号通路活性后，可逆转帕妥珠单抗耐药乳腺癌细胞对该药物的抵抗作用。

1林哲洙，张 红，张 磊，等.TRAIL-R4特异性单克隆抗体联合衣霉素促进人乳腺癌细胞凋亡〔J〕.中国老年学杂志，2015；35(19)：5433-5.

2张炜煜，杨修军，王 博，等.吉林省238株耐多药结核分枝杆菌药敏结果分析〔J〕.中国卫生工程学，2015；14(6)：540-1.

3李弘夏，谢智钦，杜立阳，等.基于HSP27的乳腺癌干细胞靶向治疗研究进展〔J〕.中国老年学杂志，2014；34(2)：561-3.

4Narayan M，Wilken JA，Harris LN，etal.Trastuzumab-induced HER reprogramming in resistant breast carcinoma cells 〔J〕.Cancer Res，2009；69(6)：2191-4.

5李 振，周爱军，孙书峰，等.乳腺癌四个分子亚型与腋窝淋巴结转移的相关性研究〔J〕.北华大学学报(自然科学版)，2015；16(3)：338-41.

6张霄蓓.乳腺癌干细胞对靶向治疗、化疗及内分泌治疗药物的敏感性研究〔D〕.天津：天津医科大学，2012.

7王建丽.驱动蛋白Kif2a在乳腺癌中表达的临床意义及功能研究〔D〕.济南：山东大学，2011.

湖北省教育厅科学研究计划指导性项目(B2015471-2)

苏坤华(1972-)，男，主管药师，主要从事药学研究。

R39

A

1005-9202(2017)20-5001-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.20.020

〔2017-05-11修回〕

(编辑 李相军/滕欣航)