siRNA TPM4对肺癌细胞增殖凋亡的影响

何建林 李 珏 杨 娜

(云南省第二人民医院呼吸内科，云南 昆明 650021)

1 胸外科

siRNA TPM4对肺癌细胞增殖凋亡的影响

何建林 李 珏1杨 娜

(云南省第二人民医院呼吸内科，云南 昆明 650021)

目的探讨原肌球蛋白(TPM)4小干扰RNA(siRNA TPM4)对肺癌细胞增殖凋亡的影响。方法以人肺癌细胞A549为研究对象，细胞转染TPM4 siRNA(TPM4 siRNA组)、siRNA control(siRNA control组)，同时设置对照组，对照组中只加入转染试剂。培养48 h后，Western印迹检测细胞TPM4、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved Caspase)-3、B细胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2的表达水平，噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果siRNA control组细胞中TPM4、Cleaved Caspase-3、Bcl-2表达水平及细胞存活率、细胞凋亡率与对照组相比均无明显差异(P>0.05)。TPM4 siRNA组细胞中TPM4表达水平及细胞存活率均明显低于对照组(P<0.01)。TPM4 siRNA组细胞中Cleaved Caspase-3表达水平及细胞凋亡率均明显高于对照组，而Bcl-2明显低于对照组(P<0.01)。结论TPM4 siRNA能够抑制肺癌细胞增殖，促进肺癌细胞凋亡。

肺癌；增殖；凋亡；原肌球蛋白4

据统计，肺癌的发病率在男性全部恶性肿瘤中位居第一，在女性全部恶性肿瘤中位居第3位〔1〕。常见的治疗肺癌的方法是手术治疗、放疗和化疗。原肌球蛋白(TPM)是一种广泛存在于哺乳动物体内的肌肉调节相关蛋白。TPM4是TPM家族的成员之一，与肿瘤的发展有关〔2〕。研究表明，TPM4在乳腺癌、肺癌、结直肠癌、胶质瘤、膀胱癌等多种癌症中均过度表达〔3〕。下调结直肠癌细胞中的TPM4表达能抑制结直肠癌细胞的增殖，促进结直肠癌细胞凋亡〔4〕。本研究旨在探讨TPM4对肺癌细胞增殖、凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1细胞 人肺癌细胞A549购自中国科学院细胞库。

1.2主要仪器及试剂 二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度检测试剂盒购于碧云天生物技术研究所；胰蛋白酶、青霉素、链霉素、噻唑蓝(MTT)均购于美国Sigma；胎牛血清购于美国Gibco；TPM4单克隆抗体、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)单克隆抗体、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)单克隆抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)单克隆抗体均购于美国CTS；LipofectamineTMRNAiMAX转染试剂购于美国Invitrogen；流式细胞仪购于美国Thermo。

1.3细胞培养 取出保存在液氮灌中的肺癌细胞A549，迅速放在37℃融化后，用含有10%胎牛血清、100 μg/ml链霉素、100 U/ml青霉素的DMEM细胞培养液悬浮细胞后，1 000 r/min离心10 min，弃上清液，加入5 ml细胞培养液重悬细胞，接种到细胞培养瓶中，放置于37℃，饱和湿度，5% CO2培养箱中培养，观察细胞融合度超过85%时，倒掉细胞培养液，加入0.25%的胰蛋白酶，放在37℃消化2 min，加入适量的细胞培养液，根据实验要求按照不同比例接种到细胞培养瓶中继续培养。

1.4细胞转染 取接种于6孔细胞培养板中且细胞浓度为70%的人肺癌细胞A549，分为对照组、TPM4 siRNA组、siRNA control组。根据实验要求，把Opti-MEM Reduced serum Medium 和MAX按照体积比为40∶1的比例混合为A液，将TPM4 siRNA、siRNA control分别与Opti-MEM Reduced serum Medium混合后为B液，将A液与B液混合，放置于室温条件下反应20 min。取浓度为70%的人肺癌细胞A549，吸除上清液，每孔中加入Opti-MEM Reduced serum Medium 2 ml孵育20 min。取A液与B液的混合物加入到细胞中，放在37℃，5% CO2培养箱中培养4 h后，更换细胞培养液继续培养。

1.5Western印迹检测转染后细胞中TPM4表达水平 取转染后培养48 h的人肺癌细胞A549，加入蛋白抽提试剂，放在冰上裂解20 min。将裂解液转移至离心管中，4℃，12 000 r/min离心15 min。移液枪吸取蛋白上清至EP管中，BCA蛋白浓度检测试剂盒对提取的蛋白定量。将提取的蛋白与5倍上样缓冲液按照体积比为4∶1的比例混合，放置在100℃的孵育器中反应5 min后，按照每孔50 μl变性蛋白样品加入到聚丙烯酰胺凝胶上样孔中，80 V电压电泳30 min后，观察溴酚蓝进入分离胶和浓缩胶边缘时，120 V电压至电泳结束。取出蛋白凝胶4℃转印至硝酸纤维素膜上。5%脱脂奶粉封闭2 h，依次与一抗(500倍稀释，4℃孵育过夜)、二抗(2 000倍稀释，37℃反应2 h)孵育后，滴加显色液，以GAPDH为内参，Image图像分析软件分析蛋白表达含量。

1.6MTT检测细胞增殖 取转染后的人肺癌细胞A549，胰蛋白酶消化后，调整细胞浓度使每毫升细胞悬浮液中含有1×105个细胞，按照每孔100 μl细胞悬浮液接种到96孔细胞培养板中培养48 h，每组设置5个复孔，同时设置空白组，空白组中不加细胞。加入5 mg/ml的MTT溶液，放在CO2培养箱中孵育反应4 h。吸除上清液，加入二甲基亚砜溶液150 μl，在避光环境中孵育10 min，酶标仪检测每孔的吸光度。

1.7流式细胞术检测细胞凋亡 取转染后的人肺癌细胞A549，胰蛋白酶消化后，收集1×106个细胞，用冰预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞2次，加入结合缓冲液充分混合后，加入碘化丙啶(PI)和膜联蛋白-V-FITC(Annexin-V-FITC)各5 μl，放置于避光条件下孵育反应20 min，加结合缓冲液400 μl，流式细胞仪检测细胞凋亡。同时用Western印迹检测转染48 h后的人肺癌细胞中Cleaved Caspase-3、Bcl-2的表达水平，步骤同1.5。

1.8统计学方法 应用SPSS22.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1转染后细胞中TPM4表达检测结果 siRNA control组细胞中TPM4表达水平(0.58±0.07)与对照组(0.58±0.06)无显著差异(P>0.05)，TPM4 siRNA组(0.12±0.08)无明显低于对照组(P<0.01)。见图1。

2.2细胞增殖检测结果 siRNA control组细胞存活率〔(99.89±1.49)%〕与对照组〔(100.24±1.06)%〕相比无显著差异(P>0.05)，TPM4 siRNA组〔(62.34±1.15)%〕明显低于对照组(P<0.01)。

2.3细胞凋亡检测结果 siRNA control组细胞凋亡率及Cleaved Caspase-3、Bcl-2水平与对照组相比无显著差异(P>0.05)。TPM4 siRNA组细胞凋亡率及Cleaved Caspase-3水平均明显高于对照组(P<0.01)，Bcl-2水平明显低于对照组(均P<0.01)。见图2，表1。

图1 转染后细胞中TPM4表达水平

图2 细胞中Cleaved Caspase-3、Bcl-2表达检测结果

组别凋亡率(%)CleavedCaspase⁃3Bcl⁃2对照组1120±132035±004051±006siRNAcontrol组1117±212035±005050±008TPM4siRNA组3247±1021)082±0081)029±0071)

与对照组比较：1)P<0.01

3 讨 论

多种因素均能引起肺癌的发生，而且肺癌早期临床症状不明显，多数患者确诊时已经是肺癌晚期。TPM4是近年来研究发现的与肿瘤发展有关的一种与肌肉收缩有关的调节蛋白〔5〕。TPM4参与调控宫颈癌、肺癌、舌鳞癌、骨肉瘤、前列腺癌等多种癌细胞的生长〔6〕。干扰结直肠癌细胞中的TPM4表达后，结直肠癌细胞凋亡增多〔4〕。

细胞增殖和凋亡是一个动态平衡的过程。在某系病理因素作用下，这种动态平衡被打破，引起疾病的发生。细胞凋亡受多种因子共同调控。Caspase是一种与细胞凋亡相关的蛋白家族，在真核细胞凋亡过程中发挥关键作用〔7〕。正常情况下，细胞内的Caspase前体没有活性，在蛋白酶的作用下被激活，从而特异性的水解底物，引起细胞凋亡〔8〕。Caspase-3是Caspase级联反应中的效应因子，其激活标志着细胞凋亡进入不可逆阶段〔9〕。Bcl-2蛋白家族是与细胞凋亡相关的另一蛋白家族，Bcl-2是Bcl-2蛋白家族的成员之一，在细胞凋亡过程中发挥抑制作用〔10〕。有研究表明，癌细胞凋亡过程中，Caspase-3过度活化，Bcl-2表达下调〔11〕。本研究结果提示，干扰TPM4 能够抑制人肺癌细胞增殖，促进人肺癌细胞凋亡。

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4赵月鸣.TPM4 在结直肠癌中的表达及其生物学意义〔D〕.长春：吉林大学,2015.

5尤 玲.TPM4 在大鼠脊髓全横断可塑性中的作用研究〔D〕.昆明：昆明医科大学,2014.

6Vasiljevic N,Ahmad AS,Carter PD,etal.DNA methylation of PITX2 predicts poor survival in men with prostate cancer〔J〕.Biomark Med,2014;8(9):1143-50.

7崔永亮,蒋军广,谭伟丽,等.凋亡相关基因 caspase-8 在非小细胞肺癌中的表达及临床意义〔J〕.中国老年学杂志,2015;35(9):2431-2.

8景晓平,程伟伟,何 丽.白藜芦醇对 MGC803 细胞凋亡因子 Bad,p-Bad,Caspase-3 的影响〔J〕.中国实验方剂学杂志,2016;22(5):147-50.

9梁晓飞,王 铭,肖永红.粉防己碱对小鼠肺成纤维细胞的凋亡及 Caspase-3 蛋白的影响〔J〕.中国临床药理学杂志,2016;32(6):531-3.

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云南省科技计划项目(No.2014FB054)

何建林(1978-)，男，主治医师，主要从事呼吸重症方面研究。

R734.2

A

1005-9202(2017)20-5003-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.20.021

〔2017-04-25修回〕

(编辑 袁左鸣/滕欣航)