硫化氢通过下调MMP-11和MMP-16改善高甲状腺素诱导的大鼠心肌纤维化

刘盛权 李 琳 龙俊蓉 谭文婷 唐 芬 刘茂军 梁 彪 李子宁 褚 春 杨 军

(南华大学附属第一医院心内科，湖南 衡阳 421001)

1 南华大学附属第二医院药剂科

硫化氢通过下调MMP-11和MMP-16改善高甲状腺素诱导的大鼠心肌纤维化

刘盛权 李 琳 龙俊蓉 谭文婷 唐 芬 刘茂军 梁 彪 李子宁 褚 春1杨 军

(南华大学附属第一医院心内科，湖南 衡阳 421001)

目的观察硫化氢(H2S)对甲状腺激素诱导的甲状腺功能亢进大鼠心肌纤维化的影响。方法通过左旋甲状腺素溶液(L-Thy，250 μg/ml)腹腔注射(10 ml·kg-1·d-1)4 w，建立甲状腺功能亢进大鼠模型。以硫氢化钠(NaHS)作为外源性H2S供体，随机将40只SD雄性大鼠等分为对照组(Control组)、模型组(L-Thy组)、H2S干预组(L-Thy+H2S组)和H2S对照组(H2S组)，4 w后处死大鼠，取左室心肌组织行Masson染色观察心肌纤维化，测量胶原容积分数(CVF)，Western印迹检测MMP-11、MMP-16、PKCα靶蛋白的表达。结果与Control组相比，L-Thy组心肌胶原纤维堆积明显增加，CVF增高(P<0.05)，而与L-Thy组相比，L-Thy+H2S组纤维化得到明显改善，CVF降低(P<0.05)；H2S组与Control组镜下改变类似，CVF无明显差异(P>0.05)；与Control组相比，L-Thy组MMP-11、MMP-16表达有显著差异(P<0.05)；与L-Thy组相比，L-Thy+H2S组MMP-11、MMP-16表达明显减低(P<0.05)，H2S组与Control组上述蛋白表达水平无明显差异(P>0.05)。各组之间PKCα蛋白表达没有明显差异(P>0.05)。结论H2S可改善甲状腺激素诱导的甲状腺功能亢进大鼠心肌纤维化，其机制可能与下调MMP-11、MMP-16表达有关，但与PKCα通路无关。

甲状腺功能亢进；心肌纤维化；H2S；MMP-11、MMP-16；PKCα

心肌重构及心肌纤维化是甲亢性心脏病主要的病理变化，其机制与甲状腺激素引起的心肌细胞代谢加速、肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)激活、交感-迷走神经张力失衡及心肌组织间炎性细胞浸润、水肿、坏死、氧化应激等有关〔1〕。心肌纤维化是多种病理因素作用下心肌间质成纤维细胞过度增殖、胶原沉积异常增加所致心肌结构与功能重构，其机制与细胞外基质的合成与降解失衡有关〔2〕。基质金属蛋白酶(MMPs)具有降解多种细胞外基质的生物活性并可导致瀑布效应，是心肌纤维化进程中的主要参与者。硫化氢(H2S)可清除氧自由基及硝基自由基，改善氧化应激损伤，目前许多研究发现其具有一定的心脏保护作用〔3〕，但H2S可否改善过量甲状腺激素作用下的心肌纤维化以及是否通过调控蛋白激酶C(PKC)α信号通路发挥作用，目前尚无相关文献报道。本研究拟探索H2S对过量甲状腺激素作用下心肌纤维化的影响及其调控机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 40只雄性SD大鼠(200±10)g，购于南华大学实验动物中心，均分笼饲养在恒温(23±1)℃环境下，采用人工照明(昼夜交替)12 h，均可自由获得粮食和水。

1.1.2实验试剂 左旋甲状腺素粉剂(L-Thy)和硫氢化钠(NaHS，H2S 供体)均购自Sigma公司；MMP-11、MMP-16和PKCα一抗以及羊抗兔二抗均购自武汉博士德公司；鼠源GAPDH 一抗购自晶欣生物公司；BCA 蛋白定量试剂盒、Masson染色试剂盒及细胞裂解液均由碧云天公司提供；电泳槽(仪)、转膜仪均购自Bio-Rad公司(美国)。

1.2方法

1.2.1模型建立及处理方案 所有参与实验的大鼠均适应性饲养1 w，此后，将40只SD大鼠随机等分为4组：对照组(Control 组)、模型组(L-Thy组)、H2S干预组(L-Thy+H2S组)和H2S对照组(H2S组)，予L-Thy(以生理盐水溶解，250 μg/ml)腹腔注射(10 ml·kg-1·d-1)4 w，建立甲亢大鼠模型；L-Thy+H2S组及H2S组每日同时予以NaHS溶液(100 μmol/kg)腹腔注射〔4〕。Control组予腹腔注射等量的生理盐水，4 w后处死并开胸取出大鼠心脏后，以 0.9%生理盐水(4℃)反复冲洗，剪去游离心肌组织，剥离后仅留左室及室间隔，取部分组织用甲醛固定，石蜡包埋，备用于Masson染色。所剩心肌组织置于-80℃保存，行Western印迹检测。

1.2.2Masson染色观察心肌纤维化〔5〕大鼠心肌组织以甲醛浸润固定，常规石蜡包埋，继之脱水，制成切片(4 μm)，Masson染色，光镜下观察心肌组织胶原纤维堆积情况，镜下胶原纤维被染成深蓝色，胞核呈蓝褐色，胞质呈红色，共取不包含血管的5个不同视野，采用IPP6.0图像分析软件进行分析处理，测量每组大鼠胶原纤维容积分数(CVF)。

1.2.3Western印迹检测心肌组织中MMP-11、MMP-16及PKCα蛋白的表达水平 取大鼠组织标本，经称量、研磨及提取总蛋白后采用BCA比色法定量，蛋白标本常规电泳、转膜、封闭、一抗孵育24 h(4℃)，继之用TBST溶液漂洗3次(每次10 min)，再以HRP 标记的二抗(稀释比例为1∶2 000)孵育1 h(37℃)，再次以TBST溶液漂洗3次(每次10 min)，ECL显影，曝光扫描，采用Image J软件对靶蛋白条带进行光密度分析，以相应条带与内参GAPDH灰度比值表示MMP-11、MMP-16、PKCα靶蛋白相对表达水平。

1.3统计学方法 采用SPSS18.0软件，计量资料行方差齐性检验，多组间均数比较行单因素方差分析(ANOVA)。

2 结 果

2.1大鼠存活情况 4 w后，有32只大鼠存活，其中Control组9只，L-Thy组7只，L-Thy+H2S组8只，H2S组8只。

2.2大鼠心肌组织Masson 染色 与Control 组相比，L-Thy组大鼠心肌细胞间大量的蓝色深染的胶原纤维堆积，CVF明显增加(P<0.05)；而与L-Thy组相比，L-Thy + H2S 组大鼠心肌细胞间胶原纤维明显减少，CVF显著减少(P<0.05)。Control 组与H2S组之间镜下胶原纤维沉积类似，CVF未见明显差异(P>0.05)，见图1。

2.3H2S对心肌组织中MMP-11、MMP-16及PKCα蛋白表达的影响 与Control 组相比，L-Thy组MMP-11、MMP-16蛋白表达明显增高(P<0.05)；与L-Thy组相比，L-Thy+H2S组MMP-11、MMP-16蛋白表达明显下调(P<0.05)；Control 组与H2S组之间MMP-11、MMP-16蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。各组之间PKCα蛋白表达未见明显差异(P>0.05)，见图2，表1。

图1 各组大鼠心肌组织Masson染色(×400)

图2 各组大鼠MMP-11、MMP-16及PKCα蛋白表达

组别MMP⁃11MMP⁃16PKCαCVFControl组0．718±0．0180．693±0．0430．580±0．0070．026±0．0003L⁃Thy组0．968±0．1111)1．009±0．0091)0．585±0．0080．128±0．00251)L⁃Thy+H2S组0．701±0．0162)0．649±0．0472)0．553±0．0080．083±0．00342)H2S组0．705±0．0040．731±0．0150．576±0．0140．033±0．0033

与Control组比较：1)P<0.05；与L-Thy组比较：2)P<0.05

3 讨 论

高甲状腺素作用于心脏引起的病理改变主要是心肌纤维化，后者是甲亢性心脏病发展到心肌重构和心功能不全的主要因素，而目前针对心肌纤维化的有效治疗策略相当有限。心肌纤维化是心肌细胞外基质(ECM)进行重塑的结果，主要与胶原的合成与降解失衡有关。MMPs是一组锌离子依赖性内肽酶，因其具有降解多种细胞外基质并形成瀑布效应的生物活性，故成为心肌纤维化进程中的主要参与者。当MMPs表达异常时导致ECM降解失衡，其在很大程度上推动了心肌纤维化的进展，目前许多研究也发现在心肌纤维化组织中，MMPs蛋白表达明显增加。MMP-11又称为基质裂解素-3，在正常的器官组织中其低表达甚至不表达，反之，则高表达，能下调体内的纤连蛋白，参与细胞凋亡及ECM重构〔6，7〕。MMP-16也称为模型基质金属蛋白酶(MT-MMP)，能特异性激活下游的MMP-2，而MMP-2属于明胶酶，既能分解变性胶原明胶，亦可分解Ⅳ、Ⅴ和Ⅶ型胶原以及纤维连接蛋白等，从而参与纤维化的进程〔8〕。本研究结果显示，过量的甲状腺激素引起了心肌纤维化，同时，高甲状腺素诱导下可导致明显大鼠心肌纤维化，并与MMP-11、MMP-16水平明显上调有关。PKC是丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶家族中的一员，具有多种亚型，而PKCα为蛋白激酶家族表达最丰富的亚型(属于经典型)，参与细胞炎症反应、增殖与凋亡、氧化应激等的调控〔9〕。PKC也参与调节MMPs 的水平和活性的调控。Song等〔10〕发现在大鼠心衰模型中PKCα表达上调，促进心肌纤维化发生。但PKC 在纤维化信号转导通路中的作用极其复杂，即使是同一种亚型的PKC在不同心脏疾病中也具有不同的作用，如PKCε激活在高血压诱导的心功能不全的发生机制中显示损害作用，却在心肌梗死模型中具有保护作用〔11〕。本研究也提示，PKCα通路可能没有参与高甲状腺素诱导的大鼠心肌纤维化的调控机制。

有研究表明，内源性或者一定浓度的外源性的H2S具有抗炎、舒张血管、促进血管平滑肌细胞凋亡和抗氧化应激等多种生物学效应，在心脑血管疾病保护中有一定作用；外源性的H2S能抑制促纤维化基因及Galectin-3 mRNA 表达水平，降低纤维化指标CTGF〔12〕。eNOS调控NO的合成是心血管保护的关键，而H2S通过调节eNOS活化及使NO生物利用度增加，在调节细胞代谢、减轻纤维化及炎症反应等方面延缓心肌纤维化及心功能不全的发生与发展〔13〕。本研究提示H2S可改善甲亢性心肌纤维化。H2S干预可通过下调MMP-11和MMP-16水平改善高甲状腺素诱导的大鼠心肌纤维化。有学者发现H2S能够调控PKCα、磷脂酰激酶-3(PI3K)及细胞外调节蛋白激酶(ERK)等信号转导分子，改善心肌缺血缺氧时的炎症反应、凋亡及氧化应激，从而改善心功能及心肌纤维化〔14〕；而H2S的心肌保护作用也与下调PKC的表达有关。本研究发现，H2S下调MMP-11和MMP-16水平以及改善大鼠心肌纤维化的机制可能与调控PKCα通路无关。本研究结果为防治甲亢性心肌病以及高甲状腺素诱导的心肌纤维化提供了新的治疗靶点及新的思路，但其具体的调控机制及信号转导通路仍需进一步研究。

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Hydrogensulfideattenuatingmyocardialfibrosisinducedbyhighthyroidhormonethroughdown-regulatingtheexpressionsofMMP-11andMMP-16inratmodels

LIUSheng-Quan,LILin,LONGJun-Rong,etal.

DepartmentofCardiology,theFirstAffiliatedHospitalofUniversityofSouthChina,Hengyang421001,Hunan,China

ObjectiveTo observe the effects of Hydrogen sulfide (H2S) on myocardial fibrosis in rat models of hyperthyroidism induced by high thyroid hormone.MethodsThe hyperthyroidism in rats were induced by intraperitoneal injection of the L-Thyroxine solution (250 μg/ml,10 ml·kg-1·d-1) for 28 days. Sodium hydrosulfide was taken as the exogenous donor of hydrogen sulfide.40 male SD mice were randomly divided into control， model， intervention of H2S(L-Thyroxine+H2S group)and control of H2S(H2S group)groups. All the mice were killed after 4 weeks, then Masson staining was performed to observe the myocardial fibrosis and the collagen volume fraction(CVF) was measured, the expression of MMP-11， MMP-16 and PKCα was detected by Western blot.ResultsCompared with control group, the myocardial fibrosis and CVF were obviously increased in the L-Thyroxine group (P<0.05). Compared with L-Thyroxine group, the myocardial fibrosis and CVF were significantly decreased in L-Thyroxine+H2S group (P<0.05), and there was no difference between control and H2S groups (P>0.05). Compared to control group, the expression of MMP-11 and MMP-16 were up-regulated in L-Thyroxine group (P<0.05), while the expression of above target proteins were down-regulated obviously in L-Thyroxine+H2S group (P<0.05), there was still no difference between control group and H2S group (P>0.05). Also, the expression of PKCα was similar in each group (P>0.05).ConclusionsThe H2S may improve the rats myocardial fibrosis of hyperthyroidism induced by thyroid hormone through regulating the expression of protein of MMP-11, MMP-16 but has nothing to do with the pathway of PKCα.

Hyperthyroidism；Myocardial fibrosis；H2S；MMP-11;MMP-16;PKCα

国家自然科学基金(81270181；81202830)

杨 军(1972-)，男，博士，教授，主任医师，硕士生导师，主要从事老年心血管疾病研究。

刘盛权(1992-)，男，在读硕士，主要从事心血管疾病及老年医学研究。

R581.1

A

1005-9202(2017)20-4985-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.20.013

〔2017-01-15修回〕

(编辑 李相军)