霉酚酸酯对阿霉素肾病大鼠血管内皮生长因子和转化生长因子-β1表达的影响

邹艳红 李春玉 刘洁薇 王丽敏 张 权 聂 磊

(佳木斯大学附属第一医院儿科，黑龙江 佳木斯 154002)

1 佳木斯市中心医院

霉酚酸酯对阿霉素肾病大鼠血管内皮生长因子和转化生长因子-β1表达的影响

邹艳红 李春玉 刘洁薇 王丽敏 张 权1聂 磊

(佳木斯大学附属第一医院儿科，黑龙江 佳木斯 154002)

目的观察霉酚酸酯(MMF)对阿霉素肾病大鼠血管内皮生长因子(VEGF)与转化生长因子(TGF)-β1表达的影响。方法应用阿霉素制造肾病综合征(NS)大鼠模型，将实验动物随机分为正常对照组、NS模型组、低剂量MMF干预组和高剂量MMF干预组。考马斯亮蓝方法检测24 h各组尿蛋白水平，酶联免疫吸附法(ELISA)检测肾组织匀浆中VEGF、TGF-β1的含量。结果干预前NS模型组、低剂量MMF干预组和高剂量MMF干预组尿蛋白含量、肾组织中VEGF、TGF-β1的表达与正常对照组差异明显(P<0.05)；MMF灌胃4、6、8 w后，低、高剂量MMF干预组尿蛋白含量、肾组织中VEGF、TGF-β1的表达较正常对照组、NS模型组均显著降低(P<0.05)；高剂量MMF干预组尿蛋白含量、肾组织中VEGF、TGF-β1的表达与低剂量MMF干预组无明显差异。结论MMF对大鼠NS的拮抗作用可能是通过下调TGF-β1和VEGF在肾组织中表达来实现的。

霉酚酸酯；阿霉素；血管内皮生长因子(VEGF)；转化生长因子(TGF)-β1

肾病综合征(NS)是各种病因引起的肾小球毛细血管通透性增高，从而生成大量蛋白尿的临床症候群。蛋白尿是NS最重要的病理生理改变，也是导致其他临床表现的基本原因。霉酚酸酯(MMF)是一种新型、高效的免疫抑制剂，可强有力地抑制淋巴细胞增殖和异种抗原所诱导的细胞毒细胞的生成，因而在临床广泛应用于移植排斥的预防和治疗。MMF能降低NS蛋白尿水平和减轻肾病病变的作用，但具体机制尚不明确〔1，2〕。本实验观察MMF是否通过调节血管内皮生长因子(VEGF)与转化生长因子(TGF)-β1在大鼠肾组织中的表达而发挥其拮抗NS的作用。

1 材料与方法

1.1主要药物、试剂和仪器 阿霉素注射液：浙江海正药业股份有限公司(国药准字H33021980)生产；MMF：上海罗氏制药有限公司(国药准字H20031240)生产；酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒购自武汉博士德生物有限公司；酶标仪：型号SAF-680T，国产。

1.2动物模型建立及分组 择健康清洁级雄性SD大鼠50只，体重180～220 g，由本校动物中心提供，生产许可证号SCXK黑2008004。 造模前实验动物适应性标准饲养3 d后，随机分为正常对照组10只、NS模型组40只。阿霉素致NS大鼠模型的制备如下〔3〕：将大鼠在非麻醉状态下固定于固定器中，一次性尾静脉注射阿霉素7 mg/kg，阿霉素在临用时用生理盐水稀释成2 mg/ml溶液。对照组用同种方法注射7 mg/kg生理盐水。注射后分笼喂养，自由进食、进水。注射后1 w收集所有大鼠24 h尿液，进行24 h尿蛋白定量，尿蛋白>100 mg/24 h为模型成功。将造模成功的30只大鼠随机分为NS模型组，低、高剂量MMF干预组，每组10只。低剂量MMF干预组每天给予8 mg/kg的MMF灌胃，高剂量MMF干预组每天给予10 mg/kg的MMF灌胃，1次/d；正常对照组和NS模型组给予等容积生理盐水灌胃，共8 w〔4，5〕。

1.3大鼠24 h尿蛋白检测 各组分别于干预前及MMF灌胃后 4、 6、 8 w末收集24 h尿液，4 000 r/min离心10 min后取上清，用考马斯亮蓝法检测尿蛋白含量。

1.4肾组织VEGF、TGF-β1表达的检测 应用ELISA检测肾组织匀浆中VEGF、TGF-β1的含量。取肾组织10 mg左右置于冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液后加入磷酸盐缓冲液(PBS)，PBS的体积总量为肾组织重量的9倍。肾组织用眼科剪刀剪碎后倒入玻璃匀浆管中充分研磨，使组织匀浆化。匀浆用低温离心机2 000 r/min 4℃离心10 min后取上清，ELISA检测步骤按试剂盒说明书进行。

1.5统计学方法 采用SPSS18.0统计软件进行t检验。

2 结 果

2.1各组24 h尿蛋白水平比较 干预前NS模型组，低、高剂量MMF干预组尿蛋白含量与正常对照组差异显著(P<0.05)；MMF灌胃4、6、8 w后，低、高剂量MMF干预组尿蛋白含量较正常对照组、NS模型组显著降低(P<0.05)；高、低剂量MMF干预组无明显差异。见表1。

2.2各组肾组织中VEGF、TGF-β1的表达 干预前NS模型组低、高剂量MMF干预组肾脏组织中VEGF、TGF-β水平较正常对照组明显升高(P<0.05)；MMF灌胃4、6、8 w后，低、高剂量MMF干预组VEGF、TGF-β1水平较正常对照组、NS模型组显著降低(P<0.05)；高剂量MMF干预组VEGF、TGF-β1水平与低剂量MMF干预组无明显差异。见表1。

表1 各组尿蛋白含量、VEGF、TGF-β1水平比较

与正常对照组比较：1)P<0.05；与NS模型组比较：2)P<0.05

3 讨 论

MMF是一种新型、高效的免疫抑制剂，广泛应用于移植排斥的预防和治疗及系统性红斑狼疮、血管炎等免疫系统疾病〔6，7〕。此外，MMF还具有抗炎作用，能直接抑制系膜细胞增殖、黏附分子的表达及许多细胞因子的产生等。有研究表明，MMF可缓解糖尿病肾病的进程，降低糖尿病大鼠的蛋白尿含量。其机制可能是通过抑制毒性细胞增殖、降低淋巴细胞黏附分子表达，减少对内皮血管的损伤而起到保护肾脏的作用〔8，9〕。TGF-β1对细胞的生长、分化和免疫功能都有重要的调节作用，TGF-β超家族是目前公认的促进肾脏疾病发展的主要细胞因子。研究表明NS患者和实验动物血、尿及肾组织中TGF-β1水平均明显高于正常对照组〔10，11〕。TGF-β1水平变化可作为反映肾纤维化程度、NS病情、判断病理类型及评价激素治疗敏感与否的指标。VEGF在正常肾脏组织中也有所表达，主要分布于肾小管细胞和肾小球足细胞中，具有增加肾脏血管通透性、促进内皮细胞分裂及增殖等作用。在缺氧、高血压、血管紧张素、高血糖等条件作用下，VEGF过表达而导致肾脏功能的损伤〔12〕。此外，研究发现TGF-β1可促进VEGF生成，TGF-β1刺激新生血管的形成是全部或部分通过VEGF来实现的〔13〕。

MMF对改善NS尿蛋白水平可能是通过下调TGF-β1和VEGF在肾组织中的表达来实现的〔14〕，但具体作用机制及TGF-β1和VEGF之间的相互作用机制还需进一步研究。

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14邹艳红，王海燕.血管内皮生长因子与肾脏疾病相关研究进展〔J〕.中国误诊学杂志，2010；10(10)：6822-3.

黑龙江省教育厅项目(No.2016-KYYWF-0606)

聂 磊(1977-)，男，医学硕士，副主任医师，主要从事神经系统疾病研究。

邹艳红(1978-)，女，医学硕士，主治医师，主要从事肾病机制的研究。

R692

A

1005-9202(2017)20-4976-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.20.009

〔2016-10-22修回〕

(编辑 苑云杰)