补泻不同配伍补阴方对衰老大鼠抗氧化能力及Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达的影响

徐 颖 梁绍栋 任公平 朱海夫 庄亚严 孙琳林

(牡丹江医学院红旗医院，黑龙江 牡丹江 157011)

补泻不同配伍补阴方对衰老大鼠抗氧化能力及Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达的影响

徐 颖 梁绍栋 任公平 朱海夫 庄亚严 孙琳林

(牡丹江医学院红旗医院，黑龙江 牡丹江 157011)

目的比较左归丸和六味地黄丸及共有“三补”药物组抗衰老的作用机制。方法观察左归丸和六味地黄丸及共有“三补”药物组对D-半乳糖(D-gal)致亚急性衰老大鼠血清和肾组织的超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量及对肾组织Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达的影响。结果亚急性衰老大鼠SOD水平下降，MDA含量升高，Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达水平上调；对于血清中的SOD活性，左归丸和六味地黄丸均有显著的升高作用，“三补”的升高作用显著；对于肾组织中的SOD活性，各给药组均无升高作用；对于血清和肾组织中的MDA，三给药组均有明显的降低作用；两补肾方和“三补”药物组均有下调肾组织促凋亡因子Bax、Caspase-3蛋白表达和上调抗凋亡因子Bcl-2蛋白表达的作用。结论两补肾方可能是通过提高SOD活力、降低MDA含量和降低Bax、Caspase-3以及升高Bcl-2表达而达到延缓衰老的效果。左归丸和六味地黄丸尽管存在补泻配伍方式的不同，但在抗衰作用上差异不显著；补泻兼顾和纯补无泻的组方思想只是在具体的药理机制上有所不同。

左归丸；六味地黄丸；抗衰老

左归丸和六味地黄丸是公认的抗衰经典方剂，均具有滋补肾阴的作用，在配伍上两方均以“三补”为基础，前者纯甘壮水、阳中求阴，后者补中寓泻、补泻兼顾〔1〕。目前，两方抗衰药理作用的实验研究较多，但在抗衰方面的研究还较少。本实验观察了左归丸和六味地黄丸及两方共有组分“三补”对D-半乳糖(D-gal)致亚急性衰老大鼠抗氧化能力和衰老相关因子蛋白表达的影响，并对两方的作用进行了分析和比较。

1 材料与方法

1.1用药及制备 六味地黄丸(熟地24 g、山药12 g、山萸肉12 g、茯苓9 g、牡丹皮9 g和泽泻9 g)、左归丸(熟地24 g、山药12 g、山萸肉12 g、菟丝子12 g、龟板胶12 g、枸杞12 g、牛膝9 g和鹿角胶12 g)及“三补”药物组(熟地24 g、山药12 g和山萸肉12 g)，中药饮片购自牡丹江医学院附属红旗医院草药局，水煎后4℃冷藏保存，煎制后浓度左归丸0.63 g/ml，六味地黄丸0.45 g/ml，“三补”药物组0.29 g/ml。

1.2动物及分组 Wistar大鼠60只(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，雌雄各半，体重(300±20)g，体重区域化后随机分为正常组、模型组、六味组、三补组和左归组，每组12只。

1.3造模及给药 根据《药理实验方法学》，选择D-半乳糖致大鼠亚急性衰老模型〔1〕：将D-gal 15 g溶于生理盐水500 ml中，配成30 mg/ml的浓度，按每日300 mg/kg给大鼠腹腔注射，正常组大鼠注射等体积生理盐水，造模周期为8 w。各给药组(即左归组、六味组和三补组)于造模开始的同时按10 ml/kg每日上午分别给予上述煎煮好的相应治疗药物，正常组和模型组给生理盐水，灌胃给药，1次/d。各给药组的给药剂量分别为左归组0.63 g/kg、六味组0.45 g/kg、三补组0.29 g/kg，给药周期为8 w。8 w后各组大鼠断头取血，分离血清，按要求保存待测。

1.4指标及检测 血和肾脏组织中超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量，测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供；肾脏组织Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达检测免疫组化试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供。均按照试剂盒提供的方法及要求进行操作，免疫组化采用Motic Med 6.0彩色病理图像分析系统进行分析和计数。

1.5统计学方法 采用SPSS22.0统计行单因素方差分析。

2 结 果

2.1对衰老大鼠血清和肾组织SOD的影响 模型组大鼠血清和肾脏组织中的SOD活力明显低于正常组(P<0.01或P<0.05)。对血清中SOD的升高作用，六味组和左归组与模型组相比具有显著差异(P<0.01或P<0.05)，三补组的作用与模型组相比差异不显著(P>0.05)；对肾组织中SOD的升高作用，各给药组与模型组相比差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2对衰老大鼠血清和肾组织MDA的影响 模型组大鼠MDA含量明显高于正常组(P<0.01)。对于血清中MDA含量的降低作用，各给药组与模型组相比均具有显著差异(P<0.05或P<0.01)；对于肾组织中MDA含量的降低作用，各给药组与模型组相比均有显著性差异(P<0.05)。见表1。

2.3对衰老大鼠肾脏组织Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达的影

响 模型组大鼠肾脏Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达明显高于正常组(P<0.01)；各给药组大鼠肾脏Bax、Caspase-3蛋白表达均降低，与模型组相比有显著差异(P<0.05或P<0.01)；各给药组大鼠肾脏Bcl-2蛋白表达升高，与模型组相比具有显著性差异(P<0.01)。见表2，图1。

表1 各组衰老大鼠SOD、MDA活性比较

与模型组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；下表同

表2 各组Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达比较

图1 各组Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达(DAB，×40)

3 讨 论

衰老的氧化损伤与自由基学说认为，衰老是细胞内成分累积性氧化损伤的最终结果，机体内的抗氧化系统对细胞损伤的减轻起着至关重要的作用，SOD和MDA就是抗氧化系统中两个非常重要的衡量指标〔2，3〕。在衰老过程中，细胞凋亡的发生亦十分关键，相关因子Bax、Bcl-2、Caspase-3均参与其中，并且抗凋亡因子Bax和促凋亡因子Bcl-2可共同激活促凋亡因子Caspase-3和其家族的其他因子，引起衰老的发生〔4，5〕。有研究显示〔6〕，肾损伤发生过程中，氧化应激起至关重要的作用，因为其可以诱导细胞凋亡和自噬的发生。

祖国医学认为肾虚是衰老的重要原因之一，肾为人体先天之本，藏精，主骨，生髓，通于脑，与衰老的发生密切相关。《素问·上古天真论》中提到女子“二七而天癸至……月事以时下故有子”，“七七……天癸竭，地道不通，故形坏而无子”；男子“二八肾气盛天癸至……故能有子……八八天癸竭，精少，肾脏衰，形体皆极，则齿发去”。说明自古肾中精气的盛衰即被认为是衰老发生的内在的根本性机制之一，因此，延年益寿中药常具有补肾填精作用。现代对于中医药抗衰老的研究亦多是围绕补肾抗衰的思路，大部分的经典补肾抗衰方均具有抗衰老的作用，如陈乔等〔7〕研究发现六味地黄丸可以改善老年大鼠的学习记忆能力，从而发挥抗衰老的作用。左归丸和六味地黄丸均是补肾阴的经典代表方剂，从配伍上看，前者以纯补无泻为组方思路，后者为补泻兼顾的全方特点，两方均是公认的补肾抗衰方。本研究显示两补肾方和“三补”药物组均有下调肾组织促凋亡因子Bax、Caspase-3蛋白表达的作用和上调抗凋亡因子Bcl-2蛋白表达的作用；提高SOD活力、降低MDA含量和降低Bax、Caspase-3以及升高Bcl-2等衰老相关因子的蛋白表达，而达到延缓衰老的效果。由此分析，不同的配伍思路对于方剂的具体药理作用可以产生不同的影响，但补泻兼顾和纯补无泻的组方思想似乎对总体的抗衰药理效果并未产生本质上的影响，只是在具体的药理机制上有所不同。

1徐叔云，卞如濂.药理实验方法学〔M〕.北京：人民卫生出版社，2006：1464-6.

2Bei C，Yi Z，Wei P，etal.Age-related changes in the central auditory system：comparison of D-galactose induced aging rats and naturally aging rats〔J〕.Brain Res，2010；1344：43-53.

3曹伍林，付晓莹，孟祥才，等.秋季全光照及水杨酸对人参叶片生理光合特性及人参皂苷类成分含量的影响〔J〕.中国实验方剂学杂志，2016；22(1)：72-7.

4Van der Burgh R，Meeldijk J，Jongeneel L，etal.Reduced serpin B9-mediated caspase-1 inhibition can contribute to autoinflammatory disease〔J〕.Oncotarget，2016；15(3)：19265-71.

5任桂萍，衣春霖，杨永碧，等.FGF-21对D-gal诱导的小鼠肝脏氧化应激及凋亡保护机制研究〔J〕.东北农业大学学报，2015；46(8)：61-9.

6罗 康，朴尚国，金英顺，等.细胞凋亡和细胞自噬在慢性环孢素A肾毒性中的作用〔J〕.中国老年学杂志，2014；34(11)：3051-3.

7陈 乔，李征峰，李 青，等.六味地黄丸对老年大鼠学习记忆及脑内M1胆碱受体阳性神经元的影响〔J〕.中国实验方剂学杂志，2013；19(3)：205-8.

ComparativestudybasedontheeffectoftheTonifyYinDecoctionwithdifferentmethodsofsupplementationanddrainingontheantioxidantcapacityandBax,Bcl-2andCaspase-3proteinexpressionsinagingrats

XUYing,LIANGShao-Dong,RENGong-Ping,etal.

HongqiHospitalAffiliatedtoMudanjiangMedicalCollege,HeilongjiangMudanjiang157011,Heilongjiang,China

ObjectiveTo analyze and compare the anti-aging function's mechanisms of the two invigorating yin formulas, Zuogui Pill and Liuweidihuang Pill.MethodsThe expressions of superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) in serum and kidney tissue, and the expressions of Bax, Bcl-2 and Caspase-3 protein in the kidney tissue of subacute aging rats induced by D-galactose were observed.ResultsThe level of SOD was reduced, the levels of MDA,the expressions of Bax, Bcl-2 and Caspase-3 were increased in subacute aging rats. The activity of SOD in serum was stepped up significantly by Zuogui Pill, Liuweidihuang Pill, also, it was rised obviously by Sanbu group. But, there was no significant difference on the activity of SOD in kidney tissue among three groups. Wherever, the MDA in serum and kidney tissue was cut down significantly in three groups. The expressions of Bax and Caspase-3, pro-apoptotic factors were cut down and the expressions of Bcl-2, anti-apoptotic factors, were stepped up in the two tonifying kidney formulas and Sanbu group.ConclusionsThe thought of the combination of supplementation and draining and the pure supplement are only different in the specific pharmacological mechanism.

Zuogui pill;Liuweidihuang pill;Anti-aging

国家自然科学基金委员会资助项目(81403316)；黑龙江省自然科学基金项目(201494)；黑龙江省教育厅科学技术研究项目(12531738)

孙琳林(1979-)，女，博士，副主任医师，副教授，主要从事中西医结合教学、临床及科研工作研究。

徐 颖(1985-)，女，硕士，助教，住院医师，主要从事中西医结合教学、临床及科研工作。

R2-03

A

1005-9202(2017)20-4974-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.20.008

〔2017-07-15修回〕

(编辑 徐 杰)