三种频率电针对慢性脑低灌注大鼠rCBF和学习记忆的影响

胡鑫豪 艾琪 冯培培 蒋持怡 韩德雄 刘喆

浙江中医药大学 杭州 310053

三种频率电针对慢性脑低灌注大鼠rCBF和学习记忆的影响

胡鑫豪 艾琪 冯培培 蒋持怡 韩德雄 刘喆

浙江中医药大学 杭州 310053

[目的]观察不同频率电针对慢性脑低灌注（Chronic cerebral hypoperfusion，CCH）模型大鼠局部脑血流量（regional cerebral blood flow，rCBF）的影响。[方法]将50只健康雄性SD大鼠随机分为假手术组（Sham）、CCH模型对照组（CCH+Model）、CCH+电针组（CCH+15Hz、CCH+2/50 Hz和CCH+2/100 Hz），每组10只。CCH模型大鼠行双侧颈总动脉结扎，不予任何干预处理；假手术组仅分离双侧颈总动脉。CCH+电针组大鼠是CCH模型给予不同频率电针干预（电针“百会”“大椎”），于术后第2天开始行电针干预（1mA，30min，每日1次，连续4周），假手术组和CCH模型组仅同等CCH+电针组抓取固定以平衡处理因素。通过激光多普勒血流仪分别检测大鼠术前、术后即刻、干预后一周、二周及四周时各组大鼠的局部脑血流量，通过Morris水迷宫（Morris water maze，MWM）实验，观察不同频率电针对CCH模型大鼠局部血流和学习记忆（逃避潜伏期）的影响。[结果]（1）局部脑血流检测：CCH造模后，各组大鼠rCBF均显示不同程度下降，术后即刻CCH模型组与CCH+电针组差异无统计学意义（P＞0.05）。与同时间点假手术组比较，CCH模型组和CCH+电针组各组大鼠的rCBF均显著下降（P＜0.01）。与同时间点CCH模型组比较，电针干预后CCH+电针组大鼠rCBF均显著升高（P＜0.01）。其中CCH+2/50Hz与CCH+2/100Hz组干预效果最好，优于各时间点CCH+15Hz组。（2）行为学检测：随训练次数的增加，各组大鼠逃避潜伏期呈下降趋势。与同时间点第2、3、4、5天假手术组比较，CCH模型组潜伏期减少缓慢（P＜0.01）；CCH+电针组潜伏期减少较快（P＜0.01或P＜0.05）。与同时间点模型组比较，CCH+电针组潜伏期减少较快（P＜0.01或P＜0.05），其中CCH+2/50Hz和CCH+2/100Hz组平台定位能力优于CCH+15Hz组（P＜0.01或P＜0.05）。[结论]不同频率电针刺激对CCH模型大鼠具有治疗效应，其机制可能与电针提高CCH模型大鼠的脑血流量进而改善其学习记忆能力有关，其中2/50Hz、2/100 Hz的刺激频率优于15Hz频率。

电针；频率；CCH（慢性脑低灌注）；rCBF（局部脑血流量）；学习记忆；认知功能

慢性脑低灌注（chronic cerebral hypoperfusion，CCH）是由各种原因引起的脑血管狭窄和（或）低灌注，脑血流量长期、慢性供应不足，导致脑代谢障碍和功能衰退的一个病理过程，临床上主要表现为不同程度的认知功能障碍[1]。它是脑动脉硬化、脑梗死、血管性痴呆、阿尔茨海默病等多种脑血管病和变性病发生、发展过程中的一个共同病理过程。随着我国社会老龄化的加剧，痴呆的发病率增高，认知障碍已经严重影响老龄人口生存质量，因此如何有效防治CCH是治疗此类疾病的重点之一。目前，大量的临床和实验研究证实电针对脑缺血后认知功能障碍有比较好的改善作用，但是电针刺激参数在其中所起的作用没有明确的结论。以往研究发现[2-3]：2Hz电针能引起中枢脑啡肽、内啡肽和内码啡肽释放，100Hz电针引起强啡肽释放，2/100Hz电针能同时释放四种阿片肽；15Hz、30Hz电针能增加星形胶质细胞的活化，而100Hz电针无此作用。因此，本实验拟通过2VO手术造模复制永久性CCH模型，分别选取15Hz、2/50Hz、2/100Hz频率对CCH模型大鼠进行电针干预，分析实验结果，讨论不同频率电针对大鼠rCBF和认知功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 健康清洁级雄性SD大鼠50只，3～4月龄，体质量300±50g，由浙江中医药大学实验动物中心提供。饲养环境维持温度在18～22℃之间，给予充足的水和饲料。

1.1.2 实验仪器 韩式电针仪（南京济生医疗科技有限公司 HANS-200A）、Morris水迷宫（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）、激光多普勒血流仪（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）、VIP小动物专业吸入麻醉机（美国 Matrx公司）、34-0313动物手术台（美国HARVARD APPARATUS公司）。

1.1.3 针灸针：华佗牌无菌针灸针（苏州医疗用品厂有限公司，规格0.30mm×25mm）

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组 实验开始前，将50只SD大鼠随机分为假手术组（Sham）、CCH模型对照组（CCH+ Model）、CCH+电针组（CCH+15Hz、CCH+2/50Hz和CCH+2/100 Hz），每组10只。

1.2.2 CCH模型制备 所有大鼠在术前一天称重，术前12h禁食，4h禁水。采用Cechetti[4]改良双侧颈总动脉结扎（Bilateral Common Carotid Artery Occlusion，2-VO）法制备永久性CCH模型。造模前所有大鼠均放入麻醉盒中麻醉，采用2%异氟烷呼吸麻醉，维持氧分压为1 mmHg，维持剂量为0.5mmHg左右，将麻醉完全的实验大鼠，仰卧位放置并固定于恒温手术台（37℃）以异氟烷吸入麻醉，充分暴露颈部，用剃毛机将颈部正中部位剃毛，为造模准备。用碘伏消毒后行颈部正中切开术，切口约1cm，小心分开两侧胸锁乳突肌，尽量避开甲状腺，分离双侧颈总动脉，用6#缝合线结扎，然后按压并用青霉素钠消毒，最后缝合内外切口并用碘伏消毒，并在伤口涂抹适量青霉素钠溶液抗感染，再将大鼠置于37℃环境中待其完全苏醒后分组治疗或予以平衡处理。

1.2.3 电针干预 电针组动物于手术造模后24h给予相应治疗性干预，将大鼠穿上特制“鼠衣”并固定在特制鼠架上，依据实验针灸学[5]取“百会”“大椎”穴(百会：顶骨正中，大椎：第7颈椎与第1胸椎间背部正中)，使用无菌针灸针（规格：0.30mm×25mm）刺入皮下1cm左右，接通HANS-200A型韩氏穴位神经刺激仪进行电针治疗，电针参数：输出电流1mA，频率为各组对应频率，时间30min/次/天。Sham组和CCH模型对照组仅进行抓取固定以平衡因素。

1.2.4 rCBF测量 采用激光多普勒血流仪检测大鼠rCBF变化：异氟烷呼吸麻醉，统一选取大鼠颅脑右颞侧（外耳道孔与后眼角连线中点）作为检测点，碘伏消毒之后作一5mm纵向切口，钝性分离肌肉组织露出骨平面，用无菌棉球蘸少许 3%双氧水清理骨平面上血渍，用特制胶水将自制的简易探头底座黏贴于骨面上。检测时将激光多普勒脑血流仪探头插入探头底座，待显示屏上稳定读值后进行监测并记录存盘（记录时间不少于3min），检测时间点为手术前5min、缺血术后随即测值及处死前5min；比较手术前、术后即刻、电针干预一周、二周及四周后rCBF的变化程度，缺血后达到缺血前70%即认为造模成功；记录缺血不同时相rCBF变化。

1.2.5 行为学检测 实验设备：水迷宫为直径180cm，深约70cm的圆柱形水池，平台为直径约12cm的圆形台面，池壁、池底与平台均为黑色。水深约50cm，温度22±1℃，平台置于水下2～3cm处。水迷宫周围用遮光帘围绕以消除周围环境影响。采用ANY-maze动物行为分析系统（ANY-maze；Stoelting，CO，USA)）跟踪记录大鼠活动情况。实验方法：本实验在大鼠造模后第23天开始进行连续6天。检测时间为每天电针干预治疗后的10～16h之间。实验时将大鼠面向池壁轻轻放入水池中，观察大鼠60s内自由航行情况。并通过自动影像跟踪系统（SMART，Panlab）进行实时采集录像。实验结束后，将影像资料采用SMART（3.0版）软件进行分析。定位航行试验：于大鼠处死前第6天开始，持续5天，每天1次，时间固定。将大鼠头朝上面向池壁从第一象限开始依次缓缓放入水中，利用软件记录大鼠自入池之后至找到平台所需时间，即逃避潜伏期。以此检测大鼠学习能力。若大鼠60s内未找到平台，则将大鼠引至平台放置10s。

1.2.6 统计学方法 统计软件采用SPSS17.0进行数据统计。实验数据以均数±标准误（mean±s.e）表示。Morris水迷宫检测数据采用重复测量方差分析；其余数据同时间点多个样本均数比较采用单因素方差分析（One-Way-ANOVA），若方差齐者，使用LSD检验；若方差不齐者，使用DunnettsT3检验；以P＜0.05或P＜0.01作为有统计学意义。

2 结果

2.1 局部脑血流量检测结果 本实验采用激光多普勒血流仪对各组大鼠在术前、术后即刻、造模后1周、2周和4周的rCBF进行检测，由实验结果可知：各组大鼠造模前差异均无统计学意义（P＞0.05），表明实验大鼠无个体差异。CCH造模后，各组大鼠（假手术组、模型组和电针组大鼠）不同时间点rCBF均显示不同程度下降，且术后即刻CCH模型组与CCH+电针组无统计学差异（P＞0.05）。与同时间点假手术组比较，CCH模型组和CCH+电针组各组大鼠的rCBF均显著下降差异有统计学意义（P＜0.01）。与同时间点CCH模型组比较，造模后1周、2周和4周时，CCH+电针组大鼠rCBF均显著升高差异有统计学意义（P＜0.01）。CCH模型组rCBF值随着缺血时间的延长有缓慢回升趋势，CCH+电针组rCBF随着干预治疗时间的延长呈快速回升趋势，其中CCH+2/50Hz与CCH+2/100Hz组干预效果最好，优于各时间点CCH+ 15Hz组，且无明显区别（P＞0.05）。提示电针能够明显改善CCH大鼠局部脑供血，且频率2/50Hz和2/100Hz优于频率15Hz。见表1、图1。

表1 不同频率电针对干预治疗CCH大鼠的影响(mean±s.e.,%) Tab.1 Effect of electroacupuncture at different frequency on interventional treatment of chronic cerebral hypoperfusion in rats（mean±s.e.,%）

2.2 不同频率电针对CCH模型大鼠行为学的影响2VO造模后第23d到27d的MWM 5天的定位航行实验中，观察假手术组、CCH模型对照组和CCH+电针组大鼠的逃避潜伏期，结果显示：随训练次数的增加，各组大鼠逃避潜伏期呈下降趋势，第一天各组间无差异。与同时间点第2、3、4、5天假手术组比较，CCH模型组潜伏期减少缓慢（P＜0.01）；CCH+电针组潜伏期减少较快，差异有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）。与同时间点CCH模型组比较，CCH+电针组潜伏期减少较快（P＜0.01或P＜0.05）。与同时间点CCH+ 15Hz组比较，可观察到除第二天外，CCH+2/50Hz和CCH+2/100Hz组大鼠的逃避潜伏期减少皆显著快于CCH+15Hz组，差异有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05），而CCH+2/50Hz和CCH+2/100Hz组间差异无统计学意义。这表明：电针干预能有效改善CCH大鼠局部脑血流循环，增强其学习记忆能力，且频率2/ 50Hz与2/100Hz要优于频率15Hz。见表2、图2。

图1 不同频率电针对干预治疗CCH大鼠的影响Figure 1 Effect of electroacupuncture at different frequencies on CCH in rats

表2 不同频率电针干预治疗对CCH大鼠平均逃避潜伏期的影响(±s.e,S) Tab.2 Effect of electroacupuncture at different frequency on the mean escape latency of chronic cerebral hypoperfusion in rats (±s.e,S)

表2 不同频率电针干预治疗对CCH大鼠平均逃避潜伏期的影响(±s.e,S) Tab.2 Effect of electroacupuncture at different frequency on the mean escape latency of chronic cerebral hypoperfusion in rats (±s.e,S)

注：与同时相假手术组比较，*P＜0.05,**P＜0.01；与同时相CCH模型组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与同时相CCH+15Hz电针组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。Note:Compared with the same time Sham group,*P＜0.05,**P＜0.01；compared with the same time CCH+Model group,▲P＜0.05,▲▲P＜0.01;compared with the same time CCH+15Hz group,△P＜0.05,△△P＜0.01.

组别 n学习训练天数Day1 Day2 Day3 Day4 Day5 Sham CCH+Model CCH+15HZ CCH+2/50HZ CCH+2/100HZ 10 10 10 10 10 49.75±1.36 50.97±2.20 50.84±2.46 50.35±2.24 50.08±2.57 25.79±2.65 50.32±1.85** 42.54±4.02** 35.45±2.43*▲35.19±1.62*▲▲△19.03±2.25 48.51±1.50** 38.98±4.96**▲28.80±3.82*▲▲△29.32±2.85*▲▲△14.7±1.75 42.50±1.91** 35.28±3.97**▲25.78±1.87*▲▲△△24.95±0.92▲▲△△15.32±1.69 40.36±2.51** 32.06±4.32**▲24.31±2.35*▲▲△23.30±1.37*▲▲△

3 讨论

图2 不同频率电针干预治疗对CCH大鼠平均潜伏期的影响Figure 2 Effect of different frequency electroacupuncture on the average latency of CCH rats

研究表明[6]，由CCH引起的局部脑血流量降低会使得大鼠出现进行性认知功能障碍，且慢性持续性脑血流下降是引起血管性痴呆的重要原因之一。电针作为目前治疗CCH的主要手段之一，其治疗方法简便，价格低廉，长期应用毒副作用小的特点颇受广大患者青睐。而电针频率作为针刺的一个重要的参数，其产生的效应也截然不同。有研究[7]显示，电针脑卒中患者头皮运动区，根据频率分为2Hz、2/15Hz、100Hz组，应用单光子发射型计算机断层(SPECT)观察3组患者电针前和电针中脑血流灌注和脑功能的变化，结果显示在固定电针的刺激强度时，分别使用2Hz、2/15Hz、100Hz三种不同的刺激频率治疗脑卒中，局部脑与全脑血流的比值(Fe)，血流功能变化率(blood functio nal changing rate,BFCR%）都有不同程度的增高，经统计学处理后发现，采用变频2/15Hz和高频100Hz刺激时，Fe和BFCR%的增高比低频2Hz更为显著(P＜0.01)。上述研究表明，以往针灸实验研究从不同角度和层次证实针刺频率不同所产生的针刺效应是有差别的。因此，我们选取临床具有代表性的波形与频率:15Hz、2/50Hz和2/100Hz，输出电流1mA，刺激时间30min作为电针组参数。

已有学者证明[8-13]，电针调节可改善局部脑血流量，从而改善其学习记忆能力。因此，本实验采用Cechetti等改良2VO法对模型组和电针组永久性结扎双侧颈总动脉制作CCH大鼠模型，可以有效地模拟如椎基底动脉狭窄、颈动脉粥样硬化斑块形成及各种慢性心脑血管疾患引起的脑供血不足而导致的认知功能缺陷性疾病；并采用Morris水迷宫对各组大鼠进行学习记忆能力的检测。Morris水迷宫检验已经成为研究学习记忆的常用方法之一[14-17]，由英国心理学家Morris创建，主要用于以评估啮齿类动物空间学习和记忆的能力[18]。本实验同样选择了检测大鼠局部脑血流量以及Morris水迷宫检验，结果显示：(1)局部脑血流量检测：各组大鼠造模前均无统计学差异（P＞0.05）。CCH造模后，各组大鼠（假手术组、CCH模型组和CCH+电针组大鼠）不同时间点rCBF均显示不同程度下降，且术后即刻CCH模型组与CCH+电针组无统计学差异（P＞0.05）。与同时间点假手术组比较，CCH模型组和CCH+电针组各组大鼠的rCBF均显著下降（P＜0.01）。与同时间点CCH模型组比较，电针干预后CCH+电针组大鼠rCBF均显著升高（P＜0.01或P＜0.05）。其中CCH+2/50Hz与CCH+2/100Hz组干预效果最好，优于各时间点CCH+15Hz组。(2)行为学检测：2VO造模后第23d到27d的MWM 5天的定位航行实验中，观察假手术组、CCH模型对照组和CCH+电针组大鼠的逃避潜伏期，结果显示：随训练次数的增加，各组大鼠逃避潜伏期呈下降趋势，第一天各组间无差异（P＞0.05）。与同时间点第2、3、4、5天假手术组比较，CCH模型组潜伏期减少缓慢（P＜0.01）；CCH+电针组潜伏期减少较快（P＜0.05或P＜0.01）。与同时间点模型组比较，CCH+电针组潜伏期减少较快（P＜0.01或 P＜0.05），其中 CCH+2/50和 CCH+2/ 100Hz组平台定位能力优于CCH+15Hz组（P＜0.01或P＜0.05）。这表明：电针干预能有效改善CCH大鼠局部脑血流循环，增强其学习记忆能力，且频率2/50Hz与2/100Hz频率要优于频率15Hz。

充足的脑血流量是大脑正常工作的基础。因此本实验在不同时间点（术前、术后即刻、术后1周、2周和4周）对各组大鼠局部脑血流进行检测，并在电针干预治疗的23d到27d进行MWM检测。通过MWM检测结果可以观察到，各组大鼠逃避潜伏期均逐渐缩短，而其相应组别（CCH模型组和CCH+电针组）的局部脑血流均逐渐升高，说明CCH模型大鼠的学习记忆功能可能与脑血流存在相关性。

综上所述，CCH模型大鼠脑血流下降同时其学习记忆能力也随之下降，电针可改善CCH模型大鼠的学习记忆能力，可能是通过上调其脑血流来改善。其中电针频率2/100Hz和2/50Hz对脑血流和学习记忆功能的改善优于其他频率。

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Effects of Electro-acupuncture at Different Frequencies on rCBF and Learning(Cognitive Function)in Rats with Chronic Cerebral Ischemia

HU Xinhao,AI Qi,FENG Peipei,et alZhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053)

[Objective]To observe the effects of different frequency electroacupuncture on regional cerebral blood flow(rCBF)in chronic cerebral hypoperfusion(CCH)rats.[Methods]Fifty SD male rats were randomly split into Sham operation group,the CCH model group,CCH+electrocardiographic group(CCH+15Hz,CCH+2/50 Hz and CCH+2/100 Hz),10 per group.CCH model rats underwent bilateral common carotid artery ligation.without any intervention;Sham operation group only isolated bilateral common carotid artery.CCH+EA group was given CCH model to give different frequency of electro-acupuncture intervention(electroacupuncture points to take"Baihui","Dazhui"two points),in the second day after the start of electro-acupuncture intervention(1mA,30min,1 time for 4 weeks).The Sham operation group and the CCH model group were treated in the same CCH+EA group to fix the factors.Regional cerebral blood flow was measured by laser Doppler flowmeter in rats before and after operation,one week,two weeks and four weeks after the intervention.Morris water maze(Morris water maze，MWM)was used to observe the effects of different frequencies of electroacupuncture on local blood flow and learning and memory(Escape Latency)in CCH model rats.[Result]1.The levels of rCBF in the CCH model group were much smaller than those in the CCH+EA group were not statistically significant(P＞0.05).The rCBF in the CCH model group and CCH+EA group were significantly lower than those in the Sham group(P＜0.01).Compared with CCH model group,rCBF was significantly increased in CCH+EA group after electroacupuncture at the same time point(P＜0.01).CCH+2/50Hz and CCH+2/100Hz groups had the best intervention effect,which was better than CCH+15Hz group each time point.2,Behavioral examinations:With the increase in the number of training,the escape latency of rats in each group showed a decreasing trend.At the same time point compared with the Sham group,the latency of the rat at the CCH model group was slowly decreased(P＜0.01)and the CCH+ electroacupuncture group was significantly decreased(P＜0.01).At the same time point compared with the CCH model group,the latency of the rat at the CCH+electroacupuncture group was quickly decreased(P＜0.01 orP＜0.05).Among the CCH+electroacupuncture group,the platform positioning capability of the rat at the CCH+2/50 Hz group and CCH+2/100Hz group was better than rat at the CCH+15Hz group(P＜0.01 orP＜0.05).[Conclusion]Different frequency electroacupuncture stimulation both has a therapeutic effect on CCH model rats,and its mechanism may be related to the improvement of learning and memory ability of CCH model rats by electroacupuncture,and 2/50Hz,2/100 Hz stimulation Frequency is better than 15Hz.

electroacupuncture;frequency;CCH(chronic cerebral hypoperfusion);rCBF(blood flow after cerebral ischemia);learning and memory;cognitive function

R282 文献标识码：A 文章编号：1005-5509（2017）10-0790-06

10.16466/j.issn1005-5509.2017.10.003

浙江省自然科学基金项目（LY16H270004）；国家自然科学基金（81273822）；浙江省科技创新团队项目（2013TD15）

Fund projects:Program of Zhejiang Provincial Natural Science Foundation(LY16H270004)；Program of National Natural Science Foundation(81273822);Key Science and Technology Innovation Team of Zhejiang Province(2013TD15)

刘喆 ,E-mail:ssrsliu＠163.com

2017-05-18）