绞股蓝总皂苷调控CLIC1抑制巨噬细胞脂质累积的作用研究

宗磊 任广岩 胡潇 郝正亮 王萃 祝骥 杨贞 卢德赵

浙江中医药大学生命科学学院 杭州 310053

绞股蓝总皂苷调控CLIC1抑制巨噬细胞脂质累积的作用研究

宗磊 任广岩 胡潇 郝正亮 王萃 祝骥 杨贞 卢德赵

浙江中医药大学生命科学学院 杭州 310053

[目的]研究绞股蓝总皂苷（gypenosides，GPs）对RAW264.7细胞脂质累积及细胞内氯离子通道蛋白1（chloride intracellular channel 1，CLIC1）表达的影响，探讨GPs抗动脉粥样硬化的分子机制。[方法]将RAW264.7细胞接种于六孔板中，分为NC组、氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein,ox-LDL）组、GPs 10组、GPs 50组、GPs 100组及CLIC1 siRNA组。各组细胞处理24h后，油红O染色检测各组细胞内脂质的累积，化学法检测细胞内总胆固醇（total cholesterol，TC）及游离胆固醇（free cholesterol，FC）的含量，荧光定量PCR和免疫印迹法检测CLIC1、CD36 mRNA和蛋白质的表达，免疫荧光技术观察CLIC1的细胞定位，并用MQAE法检测细胞内氯离子浓度的变化。[结果]与NC组相比，ox-LDL组CLIC1、CD36 mRNA（P＜0.01，P＜0.001）及蛋白（P＜0.01，P＜0.001）表达水平显著升高，细胞内TC（P＜0.001）、FC（P＜0.01）显著升高，细胞膜上CLIC1表达显著升高，细胞内氯离子浓度显著增加（P＜0.01）；经CLIC1 siRNA或GPs处理后，细胞内TC（P＜0.001，P＜0.001）、FC（P＜0.01，P＜0.01）含量降低，脂质累积减少，CLIC1、CD36 mRNA及蛋白表达水平显著下调（P＜0.01，P＜0.001）。[结论]CLIC1在巨噬细胞脂质累积中发挥着重要的作用，GPs可以通过调控CLIC1的表达抑制巨噬细胞脂质累积。

GPs；CLIC1；巨噬细胞；总胆固醇；游离胆固醇；CD36 mRNA；脂质累积；动脉粥样硬化

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是缺血性心脑血管疾病的主要病理基础，巨噬细胞摄取过多的脂质而形成泡沫细胞是AS发生发展的重要环节和典型病理特征。凋亡的泡沫细胞不断堆积可以形成动脉壁脂肪条纹[1-2]。因而，抑制巨噬细胞脂质累积是抗AS研究的重要方向[3]。绞股蓝总皂苷（gypenosides，GPs）是绞股蓝最主要的生物活性成分，具有降血脂、抗炎、抗氧化的作用，能够有效地保护心脑血管和肝脏[4-6]。现有研究证实，GPs能够明显降低AS动物血清中甘油三酯（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol， TC）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）水平，提高高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）水平[7-8]。在THP-1巨噬细胞中，GPs能降低细胞内脂质的累积，抑制泡沫细胞的形成[9]，但其机制尚未明确。

细胞内氯离子通道蛋白1（chloride intracellular channel 1，CLIC1）是一种含241个氨基酸的蛋白质[10]，广泛分布于哺乳动物的组织和亚细胞结构内，参与了许多重要的生理过程，如细胞容量的调节、细胞器的酸化、细胞容积的稳定、内质网到高尔基体的物质运输、细胞的增殖及分化[11]。CLIC1通常以可溶的形式存在于细胞质及核浆内，在细胞氧化作用下其结构发生改变，插入脂膜充当氯离子选择性通道[12-13]。已有研究表明，CLIC1在巨噬细胞细胞膜上的转移能够提高巨噬细胞的吞噬功能[14]。

因此，本研究以RAW264.7巨噬细胞为研究对象，以氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein, ox-LDL）诱导巨噬细胞脂质累积，观察CLIC1在巨噬细胞脂质累积中的作用及GPs的调控机制。

1 材料

1.1 细胞及主要试剂 RAW264.7细胞株购于中国科学院上海细胞库；DMEM高糖培养液购于杭州吉诺生物医药技术有限公司，批号：2017022705；胎牛血清购于杭州四季青生物制品公司，批号：150208；油红O粉剂购于美国Sigma公司，批号：SLBH0251V；GPs购自大连美仑生物技术有限公司（UV≥98%），批号：J0423AS；总胆固醇检测试剂盒及游离胆固醇试剂盒购自北京普利莱生物科技有限公司，批号分别为：SJ-E1015、SJE1016；健康人血清购于浙江省血液中心；CLIC1鼠单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，批号：L0815；CD36兔单克隆抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司，批号：I8836-1-AP；逆转录试剂盒、羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG购自北京康为世纪生物有限公司，批号分别为：30147、10146、10146；氯离子荧光探针N-乙氧羰基甲基-6-甲氧基溴化喹啉（MQAE）购自上海碧云天生物技术有限公司，批号：0803171509；丙二醛（MDA）试剂盒购自南京建成生物工程研究所，批号：20151223。

1.2 主要仪器 CP80MX超速离心机，日本HITACHI公司；SpectraMax190酶标仪，美国Molecular Devices公司；3111 CO2培养箱，美国Thermo Fisher Scientific公司；PowerPacTMHCBIO-RAD电泳仪，美国Bio-Rad公司；5427R低温高速离心机，德国Eppendorf公司；Stepone plus荧光定量PCR仪，美国 ABI公司；JY92-Ⅱ超声波细胞粉碎机，宁波新芝科器研究所；DMI8荧光显微镜，德国Leica公司。

2 方法

2.1 ox-LDL的制备 取健康人血浆200mL，利用序列超速离心法分离脂蛋白，取密度为1.019～1.063g·L-1的部分，经 Saphrose 6B凝胶柱层析后得到纯化的低密度脂蛋白（low density lipoprotein,LDL）。纯化后的 LDL，加入10μmol·L-1CuSO4氧化24h，而后加入10μmol·L-1的EDTA-2Na终止氧化。取少量氧化样品，用MDA试剂盒测定LDL氧化程度。于含0.2% EDTA-2Na的PBS中透析除去 Cu2+，浓缩后即得ox-LDL，再经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，BCA法测定浓度后4℃保存备用。

2.2 细胞培养及实验分组 RAW264.7细胞置于25 cm2细胞培养瓶中，在含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液中，于37°C、5%CO2培养箱静置培养，每隔2～3d传代1次。将置于25cm2细胞培养瓶中的对数生长期RAW264.7细胞消化，计数，每孔2×105个细胞接种于六孔板中，分为NC组（正常培养的RAW264.7细胞）、ox-LDL组（50μg·mL-1ox-LDL孵育RAW264.7细胞24h）、GPs 10组（10μg·mL-1GPs+50μg·mL-1ox-LDL共同孵育RAW264.7细胞24h）、GPs 50组（50 μg·mL-1GPs+50μg·mL-1ox-LDL共同孵育RAW264.7细胞24h）、GPs 100组（100μg·mL-1GPs+50μg·mL-1ox-LDL共同孵育RAW264.7细胞24h）和CLIC1 siRNA组（RAW264.7细胞转染CLIC1 siRNA 12h后，50μg· mL-1ox-LDL孵育24h），再进行后续实验。

2.3 细胞内TC及FC含量测定 细胞处理结束后，4°C、2 000r/min离心5min，收集各组细胞，以PBS冲洗3次，按照每106个细胞中加入0.1mL细胞裂解液的比例，在各组中加入细胞裂解液，离心后取上清液测定各组细胞内TC和FC的含量并用BCA法测定上清液的蛋白浓度，以每mg蛋白浓度校正TC、FC的含量。胆固醇酯与TC比值 [（CE%）]＝（TC-FC）/TC× 100%。具体操作按胆固醇检测试剂盒说明书进行。

2.4 油红O染色 细胞处理结束后，弃去各组培养液，以PBS洗3次，4%多聚甲醛固定30min，再以PBS洗3次后加入油红O染液染色30min，最后用60%异丙醇洗1次，倒置显微镜下观察染色结果并拍照。

2.5 荧光定量PCR检测CLIC1、CD36 mRNA的表达 按Trizol试剂盒说明书提取各组细胞总RNA，并按逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录成cDNA，取逆转录产物进行PCR扩增。引物序列如表1所示。反应条件为：95℃预变性10min，95℃ 15s，60℃ 60s，40个循环。调整基线和阈值读出各孔的循环数（Ct）。利用比较Ct法检测各样本CLIC1、CD36 mRNA的表达情况。倍增变化率＝2-△△Ct(△△Ct＝目的基因△Ct－内参基因△Ct）。

2.6 免疫印迹法检测泡沫细胞内CLIC1、CD36蛋白表达 细胞处理结束后，PBS洗3次，每孔加100 μL RIPA裂解液（含1μL PMSF），用刮刀将细胞刮下。转移至1.5mL离心管中，冰上裂解30min，4℃、12 000r/ min离心10min，取上清液。BCA法测定蛋白浓度，聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭2h，一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜后二抗孵育2h，洗膜，化学显影，分析各条带灰度值。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

2.7 免疫荧光观察CLIC1的细胞膜定位 将细胞接种于24×24mm盖玻片上，每片接种2×105个细胞。细胞处理完毕后，弃培养液，PBS洗3次，4%多聚甲醛室温固定15min，羊血清工作液37℃孵育60min。用PBS按说明书的比例稀释一抗，滴到细胞爬片表面，倒扣，37℃孵育2h，PBS洗3次，加入PBS稀释的二抗，37℃避光孵育1h，PBS洗3次，DAPI染核15min，甘油封片，荧光显微镜下拍照观察。

2.8 MQAE检测细胞内氯离子浓度 将细胞接种于六孔板中，每孔2×105个细胞。细胞处理完毕后，显微镜下计数，各组取相同的细胞数，离心，在含有5mmol·L-1MQAE的Krebs-HEPES缓冲液中37℃避光孵育1h，随后用Krebs-HEPES缓冲液洗涤5次，进行荧光测定，并在荧光显微镜下拍照观察。

2.9 统计学方法 采用GraphPad Prism 6.0进行数据分析，计量数据以均数±标准差（±s）表示，两组之间比较采用t检验，大于两组比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 GPs对RAW264.7细胞内TC、FC含量的影响与NC组相比，50μg·mL-1ox-LDL处理RAW264.7细胞24h后，细胞内TC与FC含量明显增加（P＜0.001，P＜0.01），CE（%）达到60%以上（P＜0.01），说明ox-LDL可以诱导巨噬细胞脂质累积，并转化成泡沫细胞。与ox-LDL组 比较，50、100μg·mL-1GPs联 合 处 理RAW264.7细胞后，细胞内TC含量（P＜0.01，P＜0.001）和CE（%）（P＜0.05，P＜0.01）均下降，说明GPs可以降低巨噬细胞脂质含量，抑制泡沫细胞形成。而CLIC1 siRNA抑制CLIC1表达后，巨噬细胞内TC（P＜0.001）、FC（P＜0.05）含量和CE（%）（P＜0.01）也下调，说明CLIC1表达参与了巨噬细胞脂质的积累。见表2。

表2 GPs对细胞内TC、FC的影响（±s,n=3）Tab.2 Effect of GPs on TC and FC in cells(±s,n=3)

表2 GPs对细胞内TC、FC的影响（±s,n=3）Tab.2 Effect of GPs on TC and FC in cells(±s,n=3)

注：与NC组比较，**P＜0.01，***P＜0.001；与ox-LDL组比较，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。Note:Compared with NC group,**P＜0.01,***P＜0.001;compared with ox-LDL group,#P＜0.05,##P＜0.01,###P＜0.001.

组别 T C（μ m o l · g -1） F C（μ m o l · g -1） C E（%）N C组o x -L D L组G P s 1 0组G P s 5 0组G P s 1 0 0组C L I C 1 s i R N A组2 0 . 2 7 ± 1 . 3 1 8 1 . 6 0 ± 3 . 6 8 *** 7 2 . 0 4 ± 3 . 0 8 5 6 . 9 5 ± 1 . 8 9 ## 3 8 . 6 5 ± 2 . 6 5 ### 3 2 . 1 5 ± 2 . 4 5 ### 1 3 . 9 6 ± 0 . 9 2 2 6 . 5 5 ± 2 . 0 9 ** 2 5 . 3 0 ± 0 . 8 3 2 4 . 8 9 ± 0 . 8 0 1 9 . 3 7 ± 0 . 9 1 # 1 8 . 7 2 ± 0 . 8 0 # 3 0 . 6 9 ± 5 . 6 0 6 7 . 2 0 ± 3 . 4 8 ** 6 4 . 6 6 ± 2 . 6 2 5 5 . 5 0 ± 1 . 4 9 # 4 7 . 8 7 ± 2 . 2 2 ## 4 1 . 4 1 ± 2 . 6 5 ##

3.2 GPs对RAW264.7细胞脂质累积的影响 如图1所示，与NC组比较，ox-LDL作用RAW264.7细胞24h后，细胞内形成明显的脂滴。与ox-LDL组比较，不同浓度的GPs处理组的细胞内脂质累积减少，并具有一定的剂量效应依赖关系，说明GPs可以减少RAW264.7细胞脂质累积。此外，CLIC1 siRNA抑制CLIC1表达后，ox-LDL诱导的RAW264.7细胞中脂质累积也明显减少，说明CLIC1可能是调控巨噬细胞脂质累积的一个重要靶点。

图1 GPs对RAW264.7细胞脂质累积的影响（油红O染色，400×，标尺50 μm）Fig.1 Effect of GPs on lipid accumulation in RAW264.7 cells(Oil red O stain,400×,bar 50 μm)

3.3 GPs对CLIC1、CD36 mRNA表达的影响 如表3所示，ox-LDL诱导后，RAW264.7细胞内CLIC1（P＜0.01）、CD36（P＜0.001）mRNA的表达显著升高；100 μg·mL-1GPs或CLIC1 siRNA处理后，ox-LDL诱导的细胞内CLIC1（P＜0.01，P＜0.001）和CD36（P＜0.001，P＜0.001）mRNA表达量显著下降。说明CLIC1的干预可以抑制CD36的表达，从而减少ox-LDL的摄入，而GPs可以通过调节CLIC1和CD36的表达，进而调控巨噬细胞脂质累积，从而延缓AS的进程。

表3 GPs对CLIC1、CD36 mRNA表达的影响Tab.3 Effects of GPs on expression of CLIC1 and CD36 mRNA

3.4 GPs对CLIC1和CD36蛋白表达的影响 免疫印迹法检测结果表明：ox-LDL可上调RAW264.7细胞内CLIC1（P＜0.01）和CD36（P＜0.001）蛋白表达，而100 μg· mL-1GPs或CLIC1 siRNA可显著降低细胞内CLIC1（P＜0.001，P＜0.001）和CD36（P＜0.01，P＜0.01）蛋白表达，此结果与转录水平的检测结果一致。见图2。

3.5 GPs对CLIC1细胞定位的影响 50μg·mL-1ox-LDL处理RAW264.7细胞24h后，细胞膜上CLIC1表达显著升高，说明ox-LDL可以促进CLIC1的膜转位。与ox-LDL组比较，CLIC1 siRNA抑制CLIC1表达后，细胞膜上CLIC1表达显著降低。此外，50 μg· mL-1ox-LDL与 50、100 μg·mL-1GPs联合处理RAW264.7细胞后，CLIC1在细胞膜上的表达显著降低，说明GPs可以调控CLIC1的膜转位，抑制氯离子通道的形成。见图3。

3.6 GPs对细胞氯离子浓度的影响 50μg·mL-1ox-LDL处理RAW264.7细胞24h后，细胞内氯离子浓度显著升高（P＜0.01）。CLIC1 siRNA抑制CLIC1表达后，氯离子浓度显著降低（P＜0.01）。与ox-LDL组比较，50、100 μg·mL-1GPs与ox-LDL联合处理后，氯离子浓度显著降低（P＜0.01，P＜0.01），说明GPs可以降低氯离子浓度。见图4。

图2 GPs对CLIC1、CD36蛋白表达的影响Fig.2 Effect of GPs on expression of CLIC1 and CD36 protein

图3 GPs对CLIC1的表达及细胞定位的影响（200×，标尺100 μm）Fig.3 Effect of GPs on the expression and localization of CLIC1(200×,bar 100 μm)

4 讨论

绞股蓝是葫芦科绞股蓝属植物绞股蓝的根状茎或全草，有千年药用历史，享有“南方人参”美誉[15]。其味甘苦、性寒，有清热解毒、化痰止咳、益气健脾之功效[16]。GPs是绞股蓝最主要的生物活性成分，具有降血脂、抗炎、抗氧化、抗AS的作用，能够有效地保护心脑血管和肝脏。体内研究表明，GPs能降低大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平，提高HDL-C水平[8]，同时降低AS大鼠细胞间黏附因子-1（intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1）、单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1,MCP-1）、MDA、LDL及主动脉壁的细胞核因子-κB p65（nuclear factor-κB p65，NF-κB p65）水平，从而发挥抗AS的作用[17]，但GPs抗AS的具体分子机制尚不清楚。

图4 GPs对细胞内氯离子浓度的影响（200×，标尺100 μm）Fig.4 Effect of GPs on intracellular Cl-concentration(200×,bar 100 μm)

AS的发病机制复杂，其发生发展与炎症反应、脂质累积及细胞增殖等紧密相关[3,18]。已有研究证实，脂质在巨噬细胞中累积形成泡沫细胞的过程是AS发生发展的重要环节。巨噬细胞通过其表面的清道夫受体CD36摄取ox-LDL形成泡沫细胞，凋亡的泡沫细胞不断堆积，形成动脉壁脂肪条纹[1-2]。因此，抑制脂质的累积，减少泡沫细胞的形成，是减缓AS进程的重要举措。体外细胞实验表明，GPs能够降低巨噬细胞中CD36基因的表达，降低细胞内脂质累积，抑制泡沫细胞的形成[9]。在本研究中，GPs处理ox-LDL诱导的巨噬细胞后，CD36基因及蛋白水平表达降低，细胞内TC、FC含量降低，细胞内脂质累积减少，说明GPs可以抑制巨噬细胞脂质累积，这与前人的研究结果是一致的。

另外，现有的研究表明AS形成与紊乱的跨膜离子的运动如Ca2+、K+等密切相关[19-20]，离子通道在离子的跨膜运动中发挥着关键的作用。而在巨噬细胞摄取ox-LDL的过程中，离子通道是否发挥作用，目前尚不清楚。CLIC1作为细胞内氯离子通道（chloride intracellular channel，CLIC）家族的一员，广泛分布于哺乳动物的组织和亚细胞结构内，参与了许多重要的生理过程如细胞容量的调节、细胞器的酸化、细胞容积稳定、内质网到高尔基体的物质运输、细胞的增殖及分化。并且，CLIC1最早从激活的巨噬细胞中克隆成功，其表达与亚细胞定位与巨噬细胞的吞噬功能密切相关。已有研究表明，CLIC1的膜转移能促进巨噬细胞的吞噬体酸化，提高巨噬细胞的吞噬功能[14]。同时，在氧化物的刺激下，以可溶形式存在于细胞质和核浆内的CLIC1，可以发生改变并插入脂膜充当氯离子选择性通道。既然CLIC1与巨噬细胞吞噬作用有关，而脂质累积又是通过巨噬细胞的吞噬作用进入到细胞内的，那么抑制CLIC1的表达，则有可能抑制巨噬细胞的吞噬作用，进而抑制脂质的累积。而在此过程中，细胞内的氯离子浓度是否发生改变，目前尚不清楚。因而，本研究采用MQAE法检测细胞内氯离子的浓度，MQAE作为使用最广泛的一种新型氯离子荧光探针，它以溴离子为配对阴离子，当氯离子浓度升高时，可置换出溴离子。因此，MQAE的荧光强度随着氯离子浓度的增加而成比例地减少。本研究发现，ox-LDL能提高巨噬细胞细胞内氯离子浓度，用CLIC1 siRNA或者不同浓度的GPs处理后，可以降低细胞内氯离子浓度，说明细胞内氯离子浓度的变化可能会与CLIC1膜转移有关，而GPs可能通过调节细胞内氯离子浓度进而调节CLIC1，从而影响巨噬细胞对脂质的吞噬。

本研究发现，ox-LDL诱导巨噬细胞后，CLIC1的mRNA及蛋白水平表达显著升高，且在细胞膜上的表达升高，说明在ox-LDL作用下，CLIC1呈现过表达，并且向细胞膜上转移，从而说明巨噬细胞吞噬ox-LDL的过程伴随着CLIC1的高表达，证明二者存在着某些关联；而CLIC1 siRNA干扰后，CD36的表达显著降低，细胞内TC、FC含量显著降低，说明CLIC1在巨噬细胞的脂质累积中发挥着重要的作用，抑制CLIC1可以降低CD36的表达，从而降低ox-LDL的摄入。不同浓度的GPs作用后，CLIC1、CD36的表达呈现下降的趋势，细胞内TC、FC含量显著降低，脂质累积减少。说明GPs可能通过调控CLIC1的表达，进而调控清道夫受体CD36的水平，从而抑制巨噬细胞对ox-LDL的吞噬。

综上所述，CLIC1在巨噬细胞的脂质累积中发挥着重要的作用，抑制CLIC1的表达可以降低巨噬细胞摄入ox-LDL。而GPs则能调控CLIC1的表达，抑制巨噬细胞脂质累积，延缓AS的进程，但其具体机制还需要进一步的探究。

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Effect of Gypenosides Inhibiting the Accumulation of Lipid in Macrophage by Regulating CLIC1

ZONG Lei,REN Guangyan,HU Xiao,et alCollege of Life Science,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053)

[Objective]To study the effect of gypenosides(GPs)on the accumulation of lipid in RAW264.7 cells and the expression of intracellular chloride channel 1(CLIC1),and investigate the molecular mechanism of anti-atherosclerosis of GPs.[Methods]RAW264.7 cells were inoculated into 6-well plates and divided into NC group,ox-LDL group,GPs 10 group,GPs 50 group,GPs 100 group and CLIC1 siRNA group.After each group had been processed, the accumulation of lipid was detected by oil red O,the total cholesterol(TC)and free cholesterol(FC)in cells were measured by chemical method,the expression of CLIC1 and CD36 were measured with the technologies of qPCR and immunoblotting.Furthermore,immunofluorescence technique was used to observe the localization of CLIC1 and the method of MQAE was used to detect the change of chloride ion concentration.[Results]Compared with the NC group,CLIC1 and CD36 were significantly increased at the mRNA level(P＜0.01,P＜0.001)and protein level(P＜0.01,P＜0.001),the intracellular TC(P＜0.001)and FC(P＜0.01)were significantly increased,the CLIC1 expression on the cell membrane and the concentration of chloride ion were significantly increased(P＜0.01)in the ox-LDL group;however,after treated with CLIC1 siRNA and different concentrations of GPs,intracellular TC(P＜0.001,P＜0.001),FC(P＜0.01,P＜0.01)content and lipid accumulation were decreased,CLIC1 and CD36 expression at the mRNA level and protein level were significantly reduced(P＜0.01，P＜0.001). [Conclusion]CLIC1 plays an important role in lipid accumulation of macrophage.GPs can inhibit accumulation of lipid by regulating CLIC1,and retard the progress of atherosclerosis.

gypenosides;CLIC1;macrophages;total cholesterol;free cholesterol;CD36 mRNA;lipid accumulation;atherosclerosis

R282 文献标识码：A 文章编号：1005-5509（2017）10-0777-07

10.16466/j.issn1005-5509.2017.10.001

国家自然科学基金（81403133）；浙江省自然科学基金（LQ14H280004，LY15H280005）

Fund projects：National Natural Science Foundation of China(81403133);Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China(LQ14H280004,LY15H280005)

卢德赵，E-mail:ludezhao＠126.com

2017-06-15）