清肺方对结缔组织病相关间质性肺炎模型大鼠抗纤维化作用的实验研究

钱康 范永升

1.浙江中医药大学附属杭州第一医院 杭州 310006 2.浙江中医药大学

清肺方对结缔组织病相关间质性肺炎模型大鼠抗纤维化作用的实验研究

钱康1范永升2

1.浙江中医药大学附属杭州第一医院 杭州 310006 2.浙江中医药大学

[目的]通过博来霉素（bleomycin，BLM）诱导建立结缔组织病相关间质性肺炎大鼠模型，探讨清肺方对间质性肺炎大鼠的抗纤维化作用。[方法]清洁级SD大鼠48只，雄性,体质量为180～200g，适应性饲养1周后，分为正常对照组、间质性肺炎模型组、强的松组和清肺方组，每组12只。除正常对照组外，其余各组通过气管内灌注5mg·kg-1BLM诱导建立大鼠间质性肺炎动物模型。用药28d后，对比清肺方组与间质性肺炎模型组、强的松组、正常对照组之间的肺组织染色及纤维化评分，检测肺组织羟脯氨酸（hydroxyproline，HYP）含量、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）、转化生长因子β1（transforming growth factor,TGF-β1）。[结果]①病理染色发现：与正常对照组比较，间质性肺炎模型组大鼠肺组织结构破坏，重度炎性细胞浸润，大块的纤维组织增生实变，肺泡腔内分布胶原纤维病灶；与间质性肺炎模型组比较，清肺方组大鼠肺组织损害减轻，炎性细胞浸润减少，纤维组织增生减少，胶原相对面积较模型组明显减少。②与正常对照组比较，各模型组大鼠肺组织HYP含量明显升高，且差异有统计学意义（P＜0.01）；与间质性肺炎模型组相比，清肺方组大鼠肺组织HYP含量明显降低，且差异具有统计学意义（P＜0.01）。③与正常对照组比较，各模型组大鼠肺组织匀浆TNF-α、IL-6、TGF-β1浓度明显升高（P＜0.05，P＜0.01）；与间质性肺炎模型组比较，清肺方组大鼠肺组织匀浆TNF-α、IL-6、TGF-β1浓度明显降低（P＜0.05，P＜0.01）。[结论]1.清肺方对BLM诱导的大鼠间质性肺炎、肺纤维化有抑制作用。2.清肺方对BLM诱导的大鼠间质性肺炎的抑制作用机制可能与TNF-α、IL-6、TGF-β1有关。

清肺方；结缔组织病；间质性肺炎；抗纤维化；HYP；TNF-α；TGF-β1；IL-6

结缔组织疾病（connective tissue disease,CTD）是以机体针对自身抗原产生多种自身抗体或致敏淋巴细胞，通过各种途径引起机体组织损伤或功能异常的一类自身免疫性疾病。不同类型的结缔组织疾病累及组织或器官的数量和损伤程度不尽相同，但几乎均可累及呼吸系统。其中，合并间质性肺炎(interstitial lung disease,ILD)是影响CTD预后、增加死亡风险的重要因素[1]。近年，随着基础研究的深入与临床检查水平的不断提高，结缔组织疾病伴发间质性肺炎(connective tissue disease-interstitial lung disease, CTD-ILD)发病率呈逐年上升趋势，晚期则表现为弥漫性肺间质纤维化引起以低氧血症为主的呼吸衰竭症状。CTD患者合并ILD发病隐匿，机制复杂，晚期糖皮质激素及免疫抑制剂效果较差，相对特发性间质性肺炎预后较差。因此，对于结缔组织病相关间质性肺炎的诊治研究就具有非常重要的意义。同时，在对该病治疗的实验研究中，动物模型的选择至关重要。有研究表明，结缔组织病相关间质性肺疾病最常见的病理类型是普通型间质性肺炎（usual interstitial pneumonitis，UIP）[2-3]，因而在动物造模中常参考UIP的动物模型进行研究。在前期研究中，研究组研究了多种建立间质性肺炎动物模型的方法，并发现向大鼠气管内灌注博来霉素（bleomycin，BLM）的方法能够成功建立间质性肺炎动物模型[4]。

本实验通过对比清肺方组与间质性肺炎模型组的肺组织病理及肺组织羟脯氨酸（hydroxyproline, HYP）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）、转化生长因子β1（transforming growth factor,TGF-β1）等变化，研究清肺方对大鼠间质性肺炎抗纤维化的作用，并初步探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 清洁级SD大鼠48只，雄性，体质量160～180g，饲养于浙江中医药大学实验动物中心，实验动物许可证号：SYXK（浙）2016-0115。动物适应性饲养1周后，将大鼠按照随机数字表法抽出12只为正常对照组，其余大鼠用BLM造模后，按照随机数字表法，将动物随机分为间质性肺炎模型组、强的松对照组、清肺方组，每组各12只。经单因素方差检验分析，各组大鼠体质量差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 实验试剂药品 清肺方由太子参12g、沙参15g、麦冬15g、冬瓜子15g、山慈菇30g、浙贝母12g、僵蚕10g、石见穿15g、芦根15g、蒲公英30g组成，所含中药均由浙江中医药大学附属杭州第一医院中药房提供，并由药剂室将上述中药加8～10倍纯水浸泡30min，武火煎开后，再文火煎煮30min，过滤，剩余药渣加入3～5倍纯水再次煎25min，药液过滤后取过滤液，将2次过滤液浓缩成含生药浓度为1.6g·mL-1的溶液，分装灭菌，-20℃保存备用。盐酸博来霉素，日本化药株式会社，批号：H20090885；强的松，西安利君沙制药股份有限公司生产，批号：090302；HYP测试盒，购自南京建成生物工程研究所，产品编号A030-2；Masson染色试剂盒，购自上海博谷生物科技有限公司，产品编号：PT003；10%水合氯醛，批号：浙药制字H020100240，浙江中医药大学校附属医院提供；TNF-α ELISA试剂盒（批号：ab100747），IL-6 ELISA试剂盒（批号：ab100722），TGF-β1ELISA试剂盒（批号：ab119557）均购自美国Abcam公司。

1.3 造模方法 大鼠按 0.35mL·100g-1剂量腹腔注射 10%水合氯醛进行麻醉，取颈前正中切口，切开皮肤，逐层分离暴露气管，气管插管后，按5mg·kg-1剂量向套管针内缓慢注入浓度为3mg·mL-1的BLM溶液，正常对照组气管内灌注同等体积的生理盐水，迅速直立并旋转，使药液均匀分布于两肺，缝合创口，动物清醒后常规喂养。造模24h后每组随机取1只大鼠进行肺组织病理切片，出现肺间质病变改变，则造模成功。

1.4 动物实验给药方法 造模成功24h后开始灌胃，按照人与动物体表面积换算方法换算，清肺方浓度为1.6g·mL-1，大鼠1mL·100g-1/d体质量进行灌胃。强的松组将药物稀释为每mL含强的松含量0.6mg的混悬液，每只大鼠的给药剂量均为1mL·100g-1体质量；正常对照组与间质性肺炎模型组则均给予等体积的0.9%氯化钠注射液灌胃。各组大鼠均连续灌胃28d，2次/d。

1.5 取材及病理标本制作 造模后连续灌胃给药28d，末次给药后禁食不禁水。末次给药后24h，大鼠腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉，剂量为0.35mL· 100g-1体质量。麻醉后，大鼠心尖部取血，离心分离血清，置于-80℃冰箱保存，以备后续检测。沿气管打开胸腔，暴露肺组织，切除双肺。10%中性甲醛固定后送病理。左肺剪成30mg大小组织块，准备HYP测定。右肺置于-80℃冰箱保存，准备病理切片染色。

1.6 肺组织HYP测定 HYP的测定按照产品说明书进行操作。简而言之，取60mg肺组织，加入1mL水解液在100℃裂解20min，用活性炭吸附有色杂质后，离心，取上清1mL，依次加入试剂1、2、3,充分反应后，取上清lmL在550nm处测光密度（optical density，OD）。

1.7 肺组织TGF-β1、IL-6及TNF-α浓度的测定肺组织匀浆TGF-β1、IL-6及TNF-α浓度的测定按照Abcam公司试剂盒说明书中的操作步骤操作。测量450nm及630nm波长处各个孔的吸光度，根据标准孔的OD值及浓度，使用Curve Expert1.3拟合标准曲线，求得公式，代入各样品孔的OD值，计算浓度，并乘以稀释倍数，求得样本浓度。

1.8 统计学方法 使用SPSS18.0软件对实验数据进行分析。检验数据正态性，符合正态分布，数据采用均数±标准差（±s）表示。组间比较用单因素方差分析（One-way ANOVA）。方差齐性时用LSD-t检验组间两两比较分析，方差不齐时用Dunnett's T3检验比较分析。以P＜0.05作为有统计学差异。

2 结果

2.1 肺组织病理HE染色 正常对照组大鼠肺组织病理HE染色可见肺泡结构清晰完好，肺泡间隔细且均匀，无明显炎性细胞浸润、充血及水肿，无明显纤维组织增生。间质性肺炎模型组大鼠肺组织病理HE染色可见肺组织结构破坏，重度炎性细胞浸润，大块的纤维组织增生实变，肺间质纤维化明显，可见实变病灶，局部有充血。清肺方组及强的松组大鼠肺组织病理HE染色均可见肺组织损害减轻，炎性细胞浸润减少，纤维组织增生减少，无实变病灶。说明清肺方及强的松均能抑制大鼠肺间质纤维化。见图1。

图1 各组大鼠肺组织HE染色(400×)Fig.1 HE staining in lung tissue of rats in each group(400×)

2.2 肺组织病理Masson染色 光镜下可见正常对照组大鼠肺泡间隔无明显胶原纤维增生，血管及气道壁少量深色胶原纤维沉积；间质性肺炎模型组大鼠肺组织可见支气管、血管周边大量深色胶原沉积，肺泡腔内分布胶原纤维病灶，有大量的深色胶原沉积，深色胶原相对面积较正常对照组明显增加；与间质性肺炎模型组相比，清肺方组及强的松组肺泡间隔及血管、支气管周边可见少量深色胶原纤维沉积，胶原相对面积较间质性肺炎模型组明显减少。可见清肺方及强的松均能抑制BLM诱导的大鼠肺间质纤维化。见图2。

图2 各组大鼠肺组织Masson染色(400×)Fig.2 Masson staining in lung tissue of rats in each group(400×)

2.3 肺组织HYP含量 与正常对照组比较，各模型组大鼠肺组织HYP含量明显升高，且差异有统计学意义（P＜0.01）。与间质性肺炎模型组相比，清肺方组、强的松组大鼠肺组织HYP含量明显降低，且差异具有统计学意义（P＜0.01）。清肺方组与强的松组大鼠肺组织HYP含量差异无统计学意义（P＞0.05）。说明清肺方及强的松均能抑制BLM诱导的大鼠间质性肺纤维化。见表1。

表1 各组大鼠肺组织HYP含量比较（±s，μg·mg-1，n=11）Tab.1 Comparison of the Hydroxyproline content in lung tissue in each group（±s，μg·mg-1，n=11）

表1 各组大鼠肺组织HYP含量比较（±s，μg·mg-1，n=11）Tab.1 Comparison of the Hydroxyproline content in lung tissue in each group（±s，μg·mg-1，n=11）

注：与正常对照组比较，▲▲P＜0.01；与间质性肺炎模型组比较，**P＜0.01。Note:Compared with normal group,▲▲P＜0.01;Compared with model group,**P＜0.01.

2.4 肺组织TGF-β1、TNF-α、IL-6检测

2.4.1 肺组织TGF-β1检测 与正常对照组比较，间质性肺炎模型组、清肺方组、强的松组大鼠肺组织匀浆TGF-β1浓度明显升高，且差异具有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。与间质性肺炎模型组比较，清肺方组、强的松组TGF-β1浓度均明显降低，且差异具有显著统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。清肺方组与强的松组之间肺组织匀浆TGF-β1浓度差异无统计学意义（P＞0.05）。可见清肺方及强的松均能抑制BLM诱导的间质性肺炎大鼠的肺组织TGF-β1，其抑制大鼠肺纤维化的作用机制与肺组织TGF-β1有关。见表2。

表2 各组大鼠肺组织TGF-β1浓度比较（±s，pg·mL-1，n=11）Tab.2 Comparison of the TGF-β1in lung tissue in each group（±s，pg·mL-1，n=11）

表2 各组大鼠肺组织TGF-β1浓度比较（±s，pg·mL-1，n=11）Tab.2 Comparison of the TGF-β1in lung tissue in each group（±s，pg·mL-1，n=11）

注：与正常对照组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与间质性肺炎模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。Note:Compared with normal group,▲P＜0.05，▲▲P＜0.01;Compared with model group,*P＜0.05，**P＜0.01.

组别肺组织T G F -β 1浓度正常对照组间质性肺炎模型组强的松组清肺方组2 8 9 9 7 5 8 7 ± 5 6 4 2 . 1 1 3 6 7 5 8 2 . 6 3 1 ± 7 8 4 3 . 2 5 5▲▲4 8 6 5 3 . 6 2 2 ± 9 6 7 3 . 4 6 8▲▲* 4 8 0 3 6 . 5 2 4 ± 8 7 6 6 . 5 9 7▲**

2.4.2 肺组织TNF-α检测 与正常对照组比较，间质性肺炎模型组、清肺方组、强的松组大鼠肺组织匀浆TNF-α浓度明显升高，且差异具有统计学意义（P＜0.05）。与间质性肺炎模型组比较，清肺方组、强的松组TNF-α浓度均明显降低，且差异具有显著统计学意义（P＜0.01）。清肺方组与强的松组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。提示清肺方及强的松均能抑制BLM诱导的间质性肺炎大鼠的肺组织TNF-α，其抑制大鼠肺纤维化的作用机制与肺组织TNF-α有关。见表3。

表3 各组大鼠肺组织TNF-α浓度比较（±s，pg·mL-1，n=11）Tab.3 Comparison of the TNF-α in lung tissue in each group（±s，pg·mL-1，n=11）

表3 各组大鼠肺组织TNF-α浓度比较（±s，pg·mL-1，n=11）Tab.3 Comparison of the TNF-α in lung tissue in each group（±s，pg·mL-1，n=11）

注:与正常对照组相比，▲P＜0.05；与间质性肺炎模型组相比，**P＜0.01。Note:Compared with normal group,▲P＜0.05;Compared with model group,**P＜0.01.

组别T N F -α浓度正常对照组间质性肺炎模型组强的松组清肺方组1 8 2 . 7 6 9 ± 2 . 8 2 1 1 9 4 . 3 6 3 ± 5 . 7 4 1▲1 8 7 . 9 2 8 ± 4 . 5 5 1▲** 1 8 7 . 6 1 9 ± 2 . 7 5 0▲**

2.4.3 肺组织IL-6检测 与正常对照组比较，间质性肺炎模型组、清肺方组、强的松组大鼠肺组织匀浆IL-6浓度明显升高，且差异具有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。与间质性肺炎模型组比较，清肺方组、强的松组IL-6浓度均明显降低，且差异具有显著统计学意义（P＜0.01）。清肺方组与强的松组之间肺组织匀浆IL-6浓度差异无统计学意义（P＞0.05）。可见清肺方及强的松均能抑制BLM诱导的间质性肺炎大鼠的肺组织IL-6，其抑制大鼠肺纤维化的作用机制与肺组织IL-6有关。见表4。

表4 各组大鼠肺组织IL-6浓度比较（±s，pg·mL-1，n=11）Tab.4 Comparison of the IL-6 in lung tissue in each group（±s，pg·mL-1，n=11）

表4 各组大鼠肺组织IL-6浓度比较（±s，pg·mL-1，n=11）Tab.4 Comparison of the IL-6 in lung tissue in each group（±s，pg·mL-1，n=11）

注:与正常对照组相比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与间质性肺炎模型组相比，**P＜0.01。Note:Compared with normal group,▲P＜0.05，▲▲P＜0.01;compared with model group,**P＜0.01.

组别I L -6浓度正常对照组间质性肺炎模型组强的松组清肺方组3 0 6 7 . 1 7 6 ± 7 2 3 . 4 3 8 6 2 3 4 . 6 3 ± 1 7 6 4 . 3 2 9▲▲5 0 2 2 . 3 9 8 ± 1 3 2 7 . 3 5 7▲▲** 4 7 2 8 . 2 2 9 ± 1 6 7 4 . 7 9 1▲**

3 讨论

结缔组织病相关间质性肺炎的发病机制目前尚不明确。当代多数医家认为，结缔组织病合并间质性肺炎可以归为中医“肺痹”“肺痿”的范畴[5]。清肺方是根据导师在临床治疗风湿病相关间质性肺炎的经验中总结出的方剂，以“培土生金”为主要治法，太子参益气健脾，生津润肺；沙参养阴清肺，益胃生津；麦冬养阴润肺，益胃生津；冬瓜子润肺化痰，消痈利水；山慈菇清热解毒，化痰散结；浙贝母清热散结，化痰止咳；僵蚕息风止痉，祛风止痛，化痰散结；石见穿活血化瘀，清热利湿，散结消肿；芦根清热生津，除烦止呕，利尿；蒲公英清热解毒，利尿散结，全方共奏益气养阴、活血祛瘀、化痰散结之效。契合结缔组织病伴间质性肺炎之气阴两虚，痰瘀互结之病机。现代药理研究证明，太子参[6]、北沙参[7]、麦冬[8]、冬瓜子[9]等均具有一些明显的抗氧化作用的成分，抑制肺纤维化的形成。

HYP是胶原纤维中的特有成分，约占胶原蛋白13.4%，其他除弹性蛋白含少量HYP(约1%)外，均不含HYP，因此HYP含量的测定已成为研究组织胶原代谢的重要方法。胶原是器官纤维化时细胞处基质（extracellular matrixc,ECM）的主要成分，所以组织中HYP含量能反应器官纤维化的程度，可作为衡量其胶原组织代谢的重要指标。本实验中清肺方组大鼠肺组织病理改变明显轻于间质性肺炎模型组，且清肺方组大鼠肺组织HYP含量低于间质性肺炎模型组，说明清肺方可抑制大鼠肺组织纤维化。

TGF-β1、TNF-α、IL-6等是与肺间质纤维化发病密切相关的细胞因子。TGF-β1可以通过Smads通路促进成纤维细胞分裂增殖并合成大量胶原蛋白，造成ECM调节失衡，因此抑制TGF-β1可以抑制肺纤维化的形成及发展[10]。同时，TGF-β1和氧化损伤、炎症因子密切相关。一项研究报道[11]，TGF-β1可刺激上皮细胞转化为间质细胞(EMT)，从而促进纤维化发展。而且，在TGF-β1等细胞因子的刺激下，成纤维细胞分化形成肌成纤维母细胞(myofibroblast)，不仅仅使产生胶原的能力大大提高，合成大量胶原蛋白，而且具有收缩性，造成ECM调节失衡[12]，肺组织结构破坏[13]。因此抑制TGF-β1可以抑制肺纤维化的形成及发展。CTD-ILD患者的血清TNF-α浓度高于RA患者，可见CTD并发ILD也与TNF-α有关，但其发生机制尚不明确。有研究表明博来霉素导致的肺纤维化与TNF-α有关[14]。IL-6由T、B细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞和几种肿瘤细胞等产生。现在认为是一种多功能细胞因子，可调节急性期反应、免疫应答和炎症。临床及实验结果均证实在间质性肺炎中IL-6是一种促炎症反应因子。在患有间质性肺炎的人和动物中均发现，IL-6的含量增多。Madam等[15]研究证明血浆中IL-1，IL-6，IL-8和IL-10的水平与CTD-ILD相关。肺组织中TGF-β1、TNF-α和IL-6的水平逐渐升高，这就说明肺组织中这些因子表达比其血浆水平更加直接反应问题。本实验结果说明清肺方对博来霉素诱导的大鼠间质性肺炎的作用机制与肺组织TGF-β1、TNF-α、IL-6浓度有关。由此可见，清肺方降低TGF-β1、TNF-α、IL-6等细胞因子的表达，可能是减轻间质性肺炎、抗肺纤维化的分子机制。

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Experimental Study on the Effect of Qingfei Decoction in Antifibrosis in Rats with Connective Tissue Disease Related Interstitial Pneumonia

QIAN Kang1，FAN Yongsheng21.Hangzhou First Peoples`Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310006)，China;2.Zhejiang Chinese Medical University

[Objective]To establish a rat model of connective tissue disease associated interstitial pneumonia induced by bleomycin,and explore the effect of Qingfei Decoction on interstitial pneumonia and its effect on antifibrosis.[Methods]48 male SD rats,weight 180～200g.All the rats were fed adaptivelly for one week and the rat model of interstitial lung disease were established by means of pour 5mg·kg-1BLM into trachea.Divided these rats into 4 groups: the normal control group,the interstitial pneumonia model group，the predmisone group and the Qingfei Decoction group.In addition,each group 12 rats. After 28 days’medication,compare the pathological difference between Qingfei Decoction group with the interstitial pneumonia model group,the predmisone group and the normal control group,and the difference in the expressions of TNF-α,IL-6,TGF-β1in lung tissue,and the expression of hydroxyproline in lung tissue.[Result]①Pathological staining showed that:compared with the normal control group,the destruction of lung tissue structure of rats pneumonia,severe inflammatory cell infiltration,fibrous tissue hyperplasia massive consolidation,alveolar distribution of collagen fiber lesions in model groups;compared with interstitial pneumonia model group,Qingfei Decoction group reduced lung tissue damage,reduce inflammation cell infiltration,fibrous tissue hyperplasia reduced collagen relative area decreased compared with model group.②Compared with normal control group,the lung tissue of HYP rats was significantly increased,and the difference was statistically significant the model group(P＜0.01);Compared with interstitial pneumonia in the model group,the content of HYP in lung tissue of rats Qingfei Decoction group decreased significantly,and the difference was statistically significant(P＜0.01).③Compared with normal control group,the model group of rat lung tissue IL-6,TNF-alpha,TGF-beta1concentration increased significantly(P＜0.05,P＜0.01);compared with the model group,interstitial pneumonia,Qingfeifang lung tissue homogenate TNF-alpha,TGF-beta 1,IL-6 concentration decreased significantly(P＜0.05,P＜0.01).[Conclusion]1.Qingfei Decoction has inhibition effect to the bleomycin induced interstitial pneumonia.2.The treatment mechanism of Qingfei Decoction to BLM-ILD maybe related to TNF-α,IL-6,TGF-β1.

Qingfei Prescription;connective tissue disease;interstitial lung disease;antifibrosis;hydroxyproline;tumor necrosis factor-α;transforming growth factor-β1;interleukin-6

R331 文献标识码：A 文章编号：1005-5509（2017）10-0784-06

10.16466/j.issn1005-5509.2017.10.002

杭州市卫生科技计划项目（2017A02）

Fund project：Program on medical and health technology of Hangzhou（2017A02）

范永升，E-mail：fyszjtcm＠163.com

2017-05-08）