Nras、Braf、Kras、Pik3ca基因突变检测在大肠癌治疗和预后中的临床价值研究

厉金雷　蔡剑辉　任约翰

[摘要] 目的 研究Nras、Braf、Kras、Pik3ca基因突变与大肠癌临床病理特征之间的关系。 方法 随机选择我院2010年2月～2013年8月期间收治的240例大肠癌患者作为研究对象，取术后肿瘤组织标本，检测Nras、Braf、Kras、Pik3ca基因突变并分析其与大肠癌患者临床病理特征之间的关系。随访3年，分析Nras、Braf、Kras、Pik3ca基因突变与患者的3年生存率的关系。 结果 240例患者Nras、Braf、Kras、Pik3ca基因突变分别占2.50%、7.92%、43.75%、4.17%。Kras突变合并Pik3ca突变占3.75%。Braf突变合并Pik3ca突变占0.42%。Kras突变合并Nras突变1例，占0.42%。Nras基因突变仅与患者的年龄有关（P<0.05）。Braf基因突变仅与患者的肿瘤原发部位、分化程度以及术后是否复发有关（P<0.05）。Kras基因突变仅与患者的年龄和病灶大小有关（P<0.05）。Pik3ca基因突变与患者的肿瘤原发部位、分化程度有关（P<0.05）。Nras、Braf、Kras和Pik3ca基因突变大肠癌患者的3年生存率均低于野生型，差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 对大肠癌患者行Nras、Braf、Kras、Pik3ca基因突变检测可以为靶向治疗提供科学依据。

[关键词] 大肠癌；Nras基因；Braf基因；Kras基因；Pik3ca基因；靶向治疗

[中图分类号] R735.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）23-0001-05

[Abstract] Objective To study the relationship between Nras， Braf， Kras， Pik3ca gene mutation and clinicopathological features of colorectal cancer. Methods A total of 240 patients with colorectal cancer who were treated in our hospital from February 2010 to August 2013 were selected. The tumor tissues were taken and the relationship between Nras， Braf， Kras， Pik3ca gene mutation and clinicopathological features of colorectal cancer were analyzed. The relationship between Nras， Braf， Kras， Pik3ca gene mutation and 3-year survival was analyzed for 3 years follow-up. Results 240 cases of Nras， Braf， Kras， Pik3ca gene mutation accounted for 2.50%， 7.92%， 43.75%， 4.17%. Kras mutations combined with Pik3ca mutations accounted for 3.75%. Braf mutation combined with Pik3ca mutation accounted for 0.42%. Kras mutation combined with Nras mutation in 1 case， accounting for 0.42%. The mutation of Nras gene was related to the age of the patient（P<0.05）. The mutations of Braf gene were related to the location of primary tumor， the degree of differentiation and postoperative recurrence（P<0.05）. Kras gene mutations were associated with age and lesion size（P<0.05）. Pik3ca gene mutation was associated with the primary site and differentiation of the tumor（P<0.05）. The 3-year survival rates of patients with Nras， Braf， Kras and Pik3ca mutations were lower than those of wild type， the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion Nras， Braf， Kras and Pik3ca mutations in patients with colorectal cancer can provide a scientific basis for targeted therapy.

[Key words] Colorectal cancer； Nras gene； Braf gene； Kras gene； Pik3ca gene； Targeted therapy

大腸癌是一种常见的恶性肿瘤，其发病率位居全球常见恶性肿瘤的第三位，死亡率位居第四位[1]。近年来其死亡率逐渐上升，传统的手术治疗和放化疗已经不能满足日益增长的发病现状。近年来精准医疗理念逐渐被接受，大肠癌的治疗也迎来靶向治疗的时代[2，3]。近年来表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）单抗药物在大肠癌中得到广泛应用[4]，其适用对象主要是Kras基因突变的患者，研究显示EGFR信号通路下游的相关基因也能影响单抗药物的靶向治疗效果，这些基因包括Nras、Braf和Pik3ca[5，6]。因此，对大肠癌患者的Nras、Braf、Kras、Pik3ca基因进行检测，研究Nras、Braf、Kras、Pik3ca基因突变与大肠癌的临床病理特征之间的关系，对大肠癌的靶向治疗和预后具有重要的意义。本研究通过Sanger测序的方法对大肠癌患者Nras、Braf、Kras、Pik3ca基因突变进行检测，并分析了Nras、Braf、Kras、Pik3ca基因突变与患者临床病理特征之间的关系，现报道如下。endprint

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择我院2010年2月～2013年8月期间经手术切除的大肠癌标本240例，其中男142例，女98例。患者的诊断参考2010年第三版世界卫生组织（World Health Organization，WHO）关于消化系统肿瘤病理学和遗传学中大肠癌的诊断标准[7]。所有切除的标本组织采用10%甲醛固定后石蜡包埋，然后HE染色，在光学显微镜下观察患者肿瘤的病理学特征，记录肿瘤的原发部位、肿瘤类型、分化程度、TNM（Tumor Node Metastasis）分期、远处转移、有无淋巴结转移、组织学类型、术后复发转移情况、肿块大小。本研究经我院医学伦理委员会的批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 设计扩增引物序列设计的扩增 Nras基因的引物序列有：exon 2：F-5-GAACCAAATGGAAGGTCACACT-3；R：5-CCTCACCTCTATGGTGGGATC-3；exon 3：F-5-TAGCATTGCATTCCCTGTGGTT-3；R：5-CCTGTAGAGGTTAATATCCGCAA-3；exon 4：F-5-GCCACTGTACCCAGCTAATCTTG-3；R：5-CACATCTCTACCAGAGTTAATCAACTGATGC-3。设计的扩增Kras基因的引物序列有：exon 2：F-5-TACTGGTGGAGTATTTGATAG-3；R：5-TGGTCCTGCACCAGTAATATG-3；exon 3：F-5-GCACTGTAA-TAATCCAGACTGTG-3；R：5-CCCACCTATAATGG-TGAATATCTTC-3；exon 4：F-5-ATGACAAAAGTT-GTGGACAGGTTTTGA-3；R：5-ATGATTTTGCAGA-AAACAGATCTGTATTTATTTCAG-3。设计的扩增Braf基因的序列有：exon 15：F-5-CCTAAACTCTTCA-TAATGCTTGCTC-3；R：5-GTGGAAAAATAGCCTC-AATTCTTACC-3。设计的扩增Pik3ca基因的引物序列有：exon 9：F-5-TGTAATCATCTGTGAATCCAG-AGG-3；R：5-TGCTGAGATCAGCCAAATTCAG-3；exon 20：F-5-CAGGAGATGTGTTACAAGGCTTATC-3；R：5-ATGCTGTTTAATTGTGTGGAAGATC-3。引物序列参考李艳艳等[8]。

1.2.2 基因突变检测 采用Qiagen公司的DAN FFPE Tissue Kit（Cat No：56404）抽提患者的腫瘤组织石蜡切片，具体操作步骤见试剂盒说明书。抽提DNA（deoxyribonucleic acid）后采用PCR扩增后直接对PCR产物进行测序的方法检测Nras、Kras、Braf和Pik3ca基因突变，PCR扩增体系为：10×PCR buffer 2 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，10 mmol/L的上下游引物各0.5 μL，DNA模板2 μL，无酶水13 μL，LA Taq酶 0.1 μL，总体积20 μL。PCR扩增的反应条件为95℃，5 min；95℃，30 s，56℃，45 s，72℃，20 s，40个循环；72℃延伸10 min。PCR完成后将PCR产物送上海桑尼生物科技有限公司测序，测序结果采用Chromas软件和Vector NTI 8.0软件进行分析。

1.3 统计学方法

本研究数据采用SPSS20.0统计学软件进行分析，计数资料以[n（%）]表示，各基因突变与患者的一般资料之间的关系采用χ2检验，Nras、Braf、Kras、Pik3ca基因突变与患者的生存率之间的关系采用Kaplan-Meier生存分析绘制生存曲线，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1各基因突变与患者临床病理特征之间的关系

本研究中240例患者共检测到6例Nras基因突变，占2.50%；19例Braf基因突变，占7.92%；105例Kras基因突变，占43.75%；10例Pik3ca基因突变，占4.17%。Nras和Kras基因突变与患者的年龄有关，年龄≥65岁患者的突变明显低于年龄<65岁的患者，差异有统计学意义（P<0.05），Braf基因突变与患者的癌症原发部位、分化程度及术后是否复发有关，差异有统计学意义（P<0.05）。Kras基因突变与患者的病灶大小有关，病灶≥3 cm的患者突变显著高于病灶<3 cm的患者，差异有统计学意义（P<0.05）。Pik3ca基因突变与患者的原发部位、分化程度有关，差异有统计学意义（P<0.05），患者的临床病理特征与各基因突变情况之间的关系见表1。

2.2 Nras、Braf、Kras、Pik3ca基因突变的类型和频率

6例Nras基因突变中，G12D突变3例，占1.25%；G12C、Q61H、Q61K突变各1例，分别占0.42%。19例Braf基因突变中均为V600E型，占7.92%。105例Kras基因突变中，G12D突变63例，占26.25%；G12V突变10例，占4.17%；G12C突变6例，占2.50%；G12S突变5例，占2.08%；G12A突变4例，占1.67%；G13D突变8例，占3.33%；Q16H突变、Q16L突变、A146T突变各2例，分别占0.83%；K117N突变、A146P突变、A146V突变各1例，分别占0.42%。10例Pik3ca基因突变中E542K突变6例，占2.50%；E545K突变和H1047R突变各2例，分别占0.83%。见表2。endprint

2.3 双基因突变情况统计

本次检测中，Kras突变合并Pik3ca突变9例，分别为G12C/E542K突变、G12D/E542K突变、G12D/E545K突变、G12V/E542K突变、G12V/E545K突变、G13D/E542K突变、G13D/H1047R突变、Q61H/E542K突变、Q61H/H1047R突变各1例，各占0.42%。Braf突变合并Pik3ca突变1例，为V600E/E542K突变，占0.42%。Kras突变合并Nras突变1例，为Q61H/A146T突变，占0.42%。见表3。

2.4 大肠癌患者的Nras、Braf、Kras、Pik3ca基因突变的生存分析

240例大肠癌患者均获得了3年的随访，对随访结构进行生存分析，结果显示Nras基因突变大肠癌患者的3年生存率为45.5%，野生型大肠癌患者3年生存率为96.3%，突变型低于野生型，差异有统计学意义（χ2=28.41，P=0.00）。Braf基因突变大肠癌患者的3年生存率为49.8%，野生型大肠癌患者3年生存率为94.2%，突变型低于野生型，差异有统计学意义（χ2=26.97，P=0.00）。Kras基因突变大肠癌患者的3年生存率为64.3%，野生型大肠癌患者3年生存率为93.3%，突变型低于野生型，差异有统计学意义（χ2=14.11，P=0.00）。Pik3ca基因突变大肠癌患者的3年生存率为49.0%，野生型大肠癌患者3年生存率为92.0%，突变型低于野生型，差异有统计学意义（χ2=18.14，P=0.00），见封三图1。

3 讨论

大肠癌的发生和发展是受多基因调控的一个复杂过程，EGFR基因是治疗大肠癌的主要靶点之一[9，10]。研究显示在EGFR信号通路中，除Kras基因外，还存在其他的耐药机制发挥作用，如Braf基因突变、配体表达以及其他信号通路被激活等因素[11，12]。相关研究显示，Kras的第二外显子以外的基因突变能够影响靶向治疗的效果[13]，因此本研究的检测范围包含了Nras基因的第二和第三个外显子、Braf基因的第15外显子、Kras基因的第二、第三、第四外显子以及Pik3ca基因的第九和第二十外显子。相关研究显示[14]，在Ras基因突变中，Kras占大多数，本研究结果显示，Kras基因突变占43.75%（105/240），主要检测到的突变类型为G12D、G12V、G12C、G12S、G12A、G13D、Q61H、Q61L、K117N、A146T、A146P、A146V，与相关研究结果一致[15]，其中第二外显子的突变占总突变的91.43%（96/105），略高于相关研究结果[16]，

本研究认为样本量是造成该差异的主要因素之一，但是也不排除地域差异的影响。另外，本研究结果显示，Kras基因突变与患者的年龄和病灶大小有关（P<0.05），与其他病理特征无关（P>0.05），患者年龄≥60岁、病灶≥3 cm时Kras基因突变率较高，对于临床大肠癌患者的治疗具有一定的指导意义，相关研究显示，Kras基因突变与患者的性别、年龄、肿瘤的部位及肿瘤的分化程度等因素有关[17]，分析研究结果的差异，一方面可能是样本数差异导致统计结果误差，另一方面可能是地域差异等因素。

据相关研究结果显示[18]，Nras基因突变在血液肿瘤中比较常见，在罗马尼亚人种中Nras基因突变的频率为9.0%～10.21%，明显高于本研究的2.50%，国内有研究结果与本研究结果一致[8]，本研究中也未能检测到第四外显子突变，与相关研究结果一致[8]，说明我国大肠癌患者中Nras基因的第四外显子突变率很低。Nras基因突变与患者的年龄有关（P<0.05），与其他病理特征无关（P>0.05），分析原因可能是由于样本量限制使检出的Nras基因突变较少。本研究检测到7.92%（19/240）的Braf基因突变，与相关研究报道的Braf突变范围一致[19]，本研究结果显示，Braf基因突变与患者的肿瘤原发部位、分化程度以及术后是否复发有关（P<0.05），与相关研究结果一致[20]，但是与有关研究不同的是本研究并未发现不同性别的大肠癌患者Braf基因突变概率之间存在明显差异。另外，本研究发现Braf突变的患者术后更容易复发和转移，推测Braf基因突变可能是大肠癌患者术后复发转移的危险因素。近年来，Pik3ca基因突变成为大肠癌患者研究的热点之一并受到广泛关注[21]。本研究结果显示，Pik3ca基因突变率为4.17%，与国内有关研究结果一致[8]，明显低于国外有关研究结果[22]，分析原因可能是Pik3ca基因突变与人种差异有关，不同人种之间Pik3ca基因突变的位点不一致，本研究仅检测到E542K、E545K和H1047R三个突变位点，是否还存在其他位点突变可能是影响该基因突变率不同的因素，本文不作深入讨论。从本研究结果可以看出，Pik3ca基因突变与患者的肿瘤原发部位、分化程度有关（P<0.05），与其他病理特征无关（P>0.05），右半结肠癌、分化程度高的患者Pik3ca基因突變率较高。有关研究显示，Pik3ca基因突变与大肠癌的远处转移密切相关[23]。有研究显示，Pik3ca基因突变可能导致Kras野生型大肠癌患者对于EGFR单抗药物不敏感[24]，因此推测Pik3ca基因突变可能解开EGFR耐药机制的谜团，成为治疗大肠癌的新靶点。另外，本研究结果显示，大肠癌患者的Nras、Braf、Kras、Pik3ca基因突变后其生存率均明显下降，显示大肠癌患者的Nras、Braf、Kras、Pik3ca基因突变筛查具有显著的临床意义，可以作为转移性大肠癌治疗和预后的重要指标进行临床检测从而指导临床靶向治疗。

综上所述，Nras基因突变与患者的年龄有关，Braf基因突变与患者的肿瘤原发部位、分化程度及术后是否复发有关，Kras基因突变与患者的年龄和病灶大小有关，Pik3ca基因突变与患者的肿瘤原发部位、分化程度有关，对大肠癌患者行Nras、Braf、Kras、Pik3ca基因突变检测可以为靶向治疗提供指导。endprint

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（收稿日期：2017-05-18）endprint