支架蛋白RACK1与蛋白激酶WEE1互作调控胃癌细胞株HGC27增殖的作用研究

任丽莉　刘超　王一曌

[摘要] 目的 研究活化的蛋白激酶C受体（Receptor for activated protein kinase C，RACK1）与蛋白激酶WEE1互作调控胃癌细胞株HGC27生长增殖及其作用机制。 方法 采用LipofectAMINE 2000在HGC27细胞中过表达RACK1，Western blotting检测HGC27细胞中WEE1蛋白表达；免疫共沉淀验证RACK1和WEE1在HGC27细胞内存在相互作用；细胞内免疫荧光观测RACK1与WEE1在HGC27细胞中的表达定位情况。 结果 过表达RACK1后WEE1在胃癌细胞HGC27中的表达降低，RACK1与WEE1在HGC27细胞内存在相互作用且共定位在细胞质内。结论 RACK1与WEE1共同作用调控胃癌的发生发展过程，为RACK1成为临床上胃癌治疗的潜在靶点提供理论基础和实验依据。

[关键词] 活化的蛋白激酶C受体；WEE1；胃癌；HGC27细胞

[中图分类号] R735.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）23-0029-04

[Abstract] Objective To study the regulatory role of the interaction of scaffolding protein RACK1 with protein kinase WEE1 in the proliferation of gastric cancer cell line HGC27 and the mechanism. Methods RACK1 was overexpressed in HGC27 cells by LipofectAMINE 2000. Western blotting was used to detect the expression of WEE1 protein in HGC27 cells. Immunoprecipitation showed that RACK1 interacted with WEE1 in HGC27 cells. Immunofluorescence was used to observe the expression and positioning of RACK1 and WEE1 in HGC27 cells. Results After expression of RACK1， the expression of WEE1 in gastric cancer cells HGC27 was decreased， and RACK1 interacted with WEE1 in HGC27 cells， and they co-localized in cytoplasm. Conclusion The interaction of RACK1 with WEE1 regulates the development and progression of gastric cancer， and it provides the theoretical basis and experimental basis for RACK1 to be a potential target for clinical treatment of gastric cancer.

[Key words] Activated protein kinase C receptor； WEE1； Gastric cancer； HGC27 cells

胃癌是最常见的恶性消化道肿瘤之一，在中国胃癌发病率位于恶性肿瘤第二名。尤其在中国的农村地区，更位于各种恶性肿瘤之首[1]。因此，对胃癌进行早期诊断和治疗十分必要。所以，寻找胃癌的分子标记物对研究胃癌发生发展就显得非常有意义。活化的蛋白激酶C受体（Receptor for activated protein kinase C，RACK1）作为支架蛋白，可介导多种蛋白的性质和功能。如和激活的PKC相互作用，调节其在细胞内定位；作为JNK或HIF1α的锚定蛋白，调节其蛋白的稳定性；和核糖体蛋白相互作用，调节细胞内蛋白的翻译；结合并整合多种信号通路的蛋白分子，调节哺乳动物的发育[2]。因而RACK1可调节体内各种生物学过程，包括信号传导、免疫应答、细胞生长、迁移和分化以及MAPK活化、血管生成、肿瘤生长、神经元反应、细胞凋亡、染色质重塑和生物钟的正常功能[3-6]。最近研究表明，RACK1在细胞周期进程中起着重要调节作用，因而备受大家关注。酵母（S.pombe）遗传学分析表明，RACK1/Cpc2调控细胞周期进程进而调节减数分裂，RACK1/Cpc2负调控WEE1蛋白水平进而正调控有丝分裂的进程[7]。很多研究证实，肿瘤的发生发展过程与RACK1在细胞内的表达水平高低有着密切的联系，例如RACK1可通過激活蛋白激酶C（PKC）进而促进肿瘤细胞的侵袭转移[8]；相关研究已表明RACK1在乳腺癌、肺癌、宫颈癌、口腔鳞癌、肠癌等多种肿瘤组织中高表达，并跟肿瘤的分期和预后有着密切的相关性[9]。虽然RACK1的高表达已经在其他多种癌组织中被证实，但RACK1在胃癌中的表达情况及其对预后的影响还不清楚。本研究旨在通过过表达RACK1蛋白后检测蛋白激酶WEE1的表达情况，并采用免疫共沉淀和免疫荧光方法检测RACK1与WEE1在胃癌细胞中的定位与相互作用，进而分析RACK1与WEE1共同作用调控胃癌的发生发展，从而为RACK1作为胃癌临床治疗的靶点提供理论基础和实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器

胃癌细胞株HGC-27由中国医科大学李丰教授惠赠。重组质粒pcDNA3.1A-flag-rack1由本实验室构建保存。LipofectAMINE 2000（Invitrogen公司，美国），Protein A/G Plus beads（Santa Cruz公司，美国），RACK1抗体（BD公司，美国），WEE1抗体（Abcam公司，美国），FITC和TRITC标记的山羊抗鼠和山羊抗兔二抗（北京中杉金桥生物公司），HRP标记的山羊抗鼠和山羊抗兔二抗，RIPA Buffer Western细胞裂解液、PMSF蛋白酶抑制剂及BCA蛋白浓度测定试剂盒、ECL化学发光试剂盒（北京碧云天生物公司）。BB16UV CO2培养箱（德国Heraeus），水浴式电转印槽DYY-Ⅲ 40B型（北京六一仪器厂），凝胶自动成像仪（UVP，美国），电泳仪及电泳槽（Bio-Rad公司，美国），激光共聚焦扫描显微镜（Leica公司，德国）。endprint

1.2 HGC27细胞培养和转染

HGC27细胞生长于含有10%灭活胎牛血清的1640培养基中（含有100 U/mL青霉素和50 μg/mL链霉素），37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养。质粒转染按照Lipo 2000转染试剂说明书进行操作。实验分为未处理组、pcDNA3.1空载体转染组、pcDNA3.1A-flag-RACK1质粒转染组三组。细胞培养48 h后收集，进行后续实验。

1.3 Western-blotting检测HGC27细胞中WEE1蛋白表达

收集并提取各组细胞总蛋白，测蛋白浓度后煮沸，冷却离心，10% SDS-PAGE电泳分离后，将蛋白转至硝酸纤维素膜上，3%BSA的TBS（pH7.4）封闭2 h，分别与anti-WEE1抗体（1∶500稀释）和β-Actin（1∶1000稀释）4℃过夜温育。TTBS洗膜3次，HRP偶联的山羊抗鼠IgG（1∶5000稀释）室温温育2 h，洗膜3次，ECL发光法进行显色，实验重复3次。

1.4 免疫共沉淀验证在HGC27细胞内RACK1和WEE1存在相互作用

收集培养48 h后HGC27细胞，加入预冷的细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂）离心后，取上清进行蛋白定量，取等量蛋白沉淀煮沸，-20℃保存。取适量预冷混悬的蛋白A/G琼脂糖珠子，加入细胞上清液孵育后离心，取上清，一部分加入l μg RACK1抗体，另一部分加入1 μg IgG后，4℃孵育2 h后，加蛋白A/G琼脂糖珠子继续孵育过夜，离心弃上清，PBS清洗剩余的珠子后离心，重复5次，保留沉淀，煮沸，离心，取上清进行SDS-PAGE电泳和转膜，以下方法同1.4，实验重复2次。

1.5 细胞间接免疫荧光观察HGC27细胞RACK1和WEE1共定位情况

接种适量HGC27细胞于6孔培养板中，内放盖玻片，培养48 h后，PBS清洗，4%多聚甲醛固定，PBS清洗3次，0.2%TritonX-100打孔，1%BSA室温封闭l h，PBS清洗3次，RACK1和WEE1抗体4℃过夜，PBS洗涤清洗，FITC和TRITC标记的山羊抗鼠和山羊抗兔IgG（1∶100）37℃避光孵育45 min，PBS清洗后，加DAPI室温复染细胞核10 min，甘油封片后，激光共聚焦显微镜下观察、成像。本组实验重复2次。

1.6 统计学方法

应用Graphpad prism 5统计学软件进行数据统计分析，WEE1蛋白表达量的变化情况以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，P<0.05差异有统计学意义。每组实验重复2～3次。

2 结果

2.1 过表达RACK1后WEE1在胃癌细胞HGC27中表达降低

转染后提取蛋白进行免疫印迹检测，与未转染组（0.35±0.06）的蛋白表达量相比，pcDNA3.1空载转染组WEE1的蛋白表达量（0.38±0.07）无明显区别，pcDNA3.1-flag-Rack1转染组WEE1蛋白表达量（0.14±0.02）明显降低，经统计分析，差异有统计学意义（P<0.05）。见封三图6。

2.2 免疫共沉淀证实RACK1与WEE1在胃癌细胞HGC27内存在相互作用

HGC27细胞裂解提取蛋白，加入beads与RACK1抗体共孵育后，洗脱beads结合的蛋白，再用WEE1抗体进行免疫沉淀检测，结果Input组与IP组在90 kDa附近检测到条带，IgG组没有检测到条带，并且IP组Wee1蛋白的表达量明显低于Input组。见封三图7。

2.3 免疫荧光检测RACK1与WEE1在胃癌细胞HGC27中共定位

细胞用相应抗体标记后，荧光显微镜观察，RACKI与WEE1主要共定位于HGC27细胞的胞质内。见封三图8。

3 讨论

支架蛋白RACK1是因为与有活性的蛋白激酶C（PKC β Ⅱ）相互作用而得名，具有七个螺旋桨结构的Trp-Asp（WD）重复序列，与G蛋白β亚单位具有同源性，又名GNB2L1[guanine nucleotide binding protein（G protein），beta polypeptide 2-like 1]，在真核生物间高度保守[10]。RACK1是细胞内的穿梭蛋白，可位于胞浆、线粒体、内质网和细胞核内。RACK1可通过与PKC结合调控核糖体翻译，来促进与侵袭转移相关因子表达。实验室前期的实验结果已表明，RACK1在胃癌组织中的表达水平要明显低于癌旁组织，且与胃癌分期紧密相关[11]，RACK1的mRNA及蛋白在胃癌细胞HGC27中的表达显著低于正常胃黏膜细胞GESY，过表达RACK1可明显抑制HGC27细胞生长增殖。

为探讨RACK1表达上调抑制胃癌细胞生长和增殖的可能机制，本研究首先通过Western bloting检测在HGC27细胞中过表达RACK1后细胞周期蛋白WEE1的表达水平，结果发现转染组WEE1的表达水平明显降低，显著低于未转染组和空载对照组。MPF是细胞周期中极其关键的调节因子。在细胞分裂间期，直到G2期结束时，WEE1蛋白激酶可通过磷酸化MPF的重要组分-Cdc2上的Thr14和Tyr15残基使MPF处于失活状态。WEE1是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与末端磷酸化，还可失活细胞周期蛋白依赖性激酶1（Cyclin dependent kinase 1，CDK1），从而导致DNA损伤应答而阻滞G2期细胞周期，负性调控细胞有丝分裂的进行[12]。有研究发现，WEE1在恶性黑色素瘤、乳腺癌、骨肉瘤和神经胶质瘤等一些肿瘤中高表达[13-16]，但在胃癌中如何表达还不清楚。

目前仅有Kim HY等[12]报道WEE1在胃癌组织中高表达且与伴有淋巴结转移的男性胃癌患者不良预后密切相关，同时检测WEE1在12种胃癌细胞株中的表达，7株高表达，5株表达很少或不表达，文中没有检测WEE1在HGC27细胞中的表达情况。实验室前期的研究中已发现WEE1在HGC27细胞中的表达水平要明显低于正常胃黏膜细胞GESY，本研究中过表达RACK1抑制WEE1蛋白的表达，具体的机制还不清楚。正常细胞修复损伤的DNA主要在G1期阻滞，然而癌细胞經常在G1期阻滞有缺陷，很大程度上取决于G2期阻滞，因此，与正常细胞相比，癌细胞在G2期检查点增加了DNA损伤的程度[12]，本研究中在HGC27细胞中过表达RACK1可能破坏了G2/M期检查点的平衡，抑制了细胞增殖。既然RACK1的改变影响了WEE1蛋白的表达，两者是如何相互作用的呢？我们又应用免疫共沉淀实验来验证在胃癌HGC27细胞中RACK1与WEE1存在相互作用。endprint

为了进一步研究RACK1与WEE1在胃癌细胞中的关系，我们进行了免疫荧光共定位观察到了这两个蛋白在胃癌的亚细胞结构中的共定位情况，证实二者共定位于HGC27细胞胞质中。这些实验结果充分说明RACK1与WEE1在胃癌细胞HGC27中能够共定位，有着十分紧密的互作关系，对胃癌的发生发展有着一定的影响作用。由此可推测，RACK1与WEE1在细胞中的相互作用可能是调控胃癌细胞生长增殖的主要机制之一。但RACK1与WEE1是如何互作以及如何调控胃癌发生的具体机制还需进一步的研究探讨。

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（收稿日期：2017-05-06）endprint