三叶青黄酮对荷Lewis肺癌小鼠脾脏单个核细胞PGE2、COX-2表达的影响

张祺箐 冯正权

三叶青黄酮对荷Lewis肺癌小鼠脾脏单个核细胞PGE2、COX-2表达的影响

张祺箐 冯正权

目的 研究三叶青黄酮对荷Lewis肺癌小鼠脾脏单个核细胞前列腺素E2（PGE2）、环氧化酶-2（COX-2）表达的影响。方法 皮下接种法建立Lewis肺癌小鼠动物模型，接种14天后取脾脏，分离单个核细胞培养，以转化生长因子β1（TGF-β1）刺激为模型组，塞来昔布（SC58635）为阳性对照，设三叶青黄酮低、中、高浓度组，无TGF-β1及药物为空白对照组。ELISA法测定单个核细胞分泌 PGE2、COX-2 浓度。结果 TGF-β1 刺激 24h 后，与空白对照组 PGE2（99.31±3.82）pg/mL、COX-2（290.49±5.37）pg/mL 比较，其余五组 PGE2、COX-2 均明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。模型组脾脏单个核细胞体外分泌PGE2[（138.18±4.00）pg/mL]、COX-2[（331.58±5.78）pg/mL]含量最高。与模型组比较，给药组PGE2、COX-2含量均明显下降，差异有统计学意义（P＜0.01）。PGE2含量依次为塞来昔布组（110.13±2.38）pg/mL＜三叶青黄酮高剂量组（118.18±1.96）pg/mL＜中剂量组（121.62±4.44）pg/mL＜低剂量组（128.90±4.24）pg/mL。COX-2含量依次为塞来昔布组（309.51±2.85）pg/mL＜三叶青黄酮高剂量组（319.64±2.29）pg/mL＜中剂量组（323.92±2.61）pg/mL＜低剂量组（327.07±4.53）pg/mL。给药组组间差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。结论 三叶青黄酮在体外可能通过影响PGE2、COX-2表达水平，改善肿瘤微环境，起到抗肿瘤作用，其作用与剂量呈正比。

荷Lewis肺癌小鼠；三叶青黄酮；单个核细胞；环氧化酶-2；前列腺素E2

1979年Lord正式提出了“肿瘤微环境”，指肿瘤在发生、发展过程中所处的内环境，由肿瘤细胞本身、间质细胞、微血管、微淋巴管、组织液、众多细胞因子及少量浸润细胞等共同构成[1]。肿瘤微环境中炎症因子、肿瘤细胞产生的细胞因子、肿瘤间质细胞分泌Toll样受体、补体等通过不同信号通路众多途径发挥负向免疫作用。其中，转化生长因子β（transforming growth factors-β，TGF-β）和程序性死亡配体1（programmed death ligand 1，PD-L1） 通过抑制 T细胞免疫反应，促进肿瘤的发生、发展。近年研究发现异常炎性反应（PGE2/COX2通路）和肿瘤介导的免疫抑制（TGF-β诱导Treg）存在一定的关联性[2]。研究[3-4]发现，PGE2均能在体内外刺激Treg生成，而肿瘤衍生的环氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）能促进Treg表型的生成。笔者前期研究显示，三叶青黄酮通过抑制荷瘤小鼠Treg细胞表达，降低外周血中PGE2、COX-2的含量[5]。本次实验以塞来昔布为阳性对照，通过三叶青黄酮体外干预，观察其对肺癌小鼠脾脏单个核细胞分泌PGE2、COX-2的影响，进一步研究其在调节肿瘤免疫的效应及机制，为临床应用提供实验依据。

1 实验材料

1.1 实验动物 健康SPF级雌性C57BL/6小鼠5只，5 周龄，体质量（16.80±0.60）g，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，许可证：SCXK（沪）2013-0016。Lewis肺癌细胞株由中国科学院上海生命科学研究院提供，由浙江中医药大学动物实验中心对Lewis细胞进行传代培养。

1.2 实验药品 三叶青购于浙江省中医院中药房，经浙江中医药大学药学院鉴定，质量均符合实验使用要求。Celecoxib（SC58635）购自 Selleck Chemicals公司。

1.3 主要试剂和仪器 小鼠组织单个核细胞分离液（天津灏洋生物公司）；RPMI1640培养液（双抗）、PBS、二甲基亚砜（DMSO）（吉诺生物有限公司）；胎牛血清（杭州四季青生物有限公司）；0.9%氯化钠注射液（浙江省立同德医院）；Recombinant Human TGF-β1（PeproTech公司）；重组细胞因子溶解稀释液套装（联科生物公司）；小鼠PGE2 ELISA试剂盒和小鼠COX-2 ELISA试剂盒（R&D公司）；ELX800全自动酶标仪（美国宝特公司）。

2 实验方法

2.1 荷Lewis肺癌小鼠模型建立 皮下接种法[6]：待Lewis细胞数目及质量满足接种要求后，将细胞离心分离，然后用PBS液稀释，混匀制成细胞混悬液（1.0×107/mL）备用。将细胞混悬液接种于已消毒的5只C57BL/6小鼠右侧腋窝皮肤，每只0.2mL。观察接种小鼠成瘤情况。接种后第8天，在小鼠右侧腋窝皮肤下能触及肿瘤，用游标卡尺测量其最短直径≥8mm，即算造模成功。

2.2 分离脾脏单个核细胞培养 造模成功后，接种后14天，颈椎脱臼处死小鼠，用75%酒精浸泡5min，在无菌条件下摘取脾脏，经200目的筛网研碎过滤，1000转/分，离心5min，收集细胞，用密度梯度离心法分离脾脏单个核细胞。细胞计数后，用RPMI1640（双抗）+10%胎牛血清稀释，调整细胞浓度为1.0×106/mL。

2.3 制备三叶青黄酮 根据文献[7]方法提取三叶青黄酮，再依据冯正权等[8]研究，使三叶青黄酮粉末溶于二甲基亚砜中，旋涡震荡，全部溶解过滤除菌，用RPMI1640培养液（双抗）稀释，旋涡震荡混匀后放置于4℃冰箱保存备用。以三叶青粉末最大溶解度为高剂量，设高、中、低终浓度分别为 12.5、6.25、3.125μg/mL。设塞来昔布（SC58635）为阳性对照组，终浓度为12.5μg/mL。

2.4 三叶青黄酮对单个核细胞的干预作用 目前未有类似三叶青黄酮体外干预在TGF-β1刺激后脾脏单个核细胞分泌PGE2、COX-2含量的相关研究。为摸索合适的TGF-β1刺激浓度和观察时间点，进行了一组预实验，分别用 0、5、10、20ng/mL 的 TGF-β1刺激，观察 24、48、72h，显示 5ng/mL TGF-β1 刺激24h，单个核细胞分泌的PGE2含量最高。因此设5ng/mL为TGF-β1刺激浓度。用含10%胎牛血清的1640（双抗）培养液培养的小鼠脾脏单个核细胞以9.0×105/孔接种于24孔板，模型组加入终浓度为5ng/mL的TGF-β1刺激，三叶青黄酮低、中、高浓度组分别加 入 12.5、6.25、3.125μg/mL 的 三 叶 青 黄 酮 溶 液75μL，阳性对照组加 12.5μg/mL 塞来昔布（SC58635）溶液75μL，不加TGF-β1及药物者为空白对照组。每剂量组3孔，置于37℃，5%CO2的培养箱中培养。观察时间为12、24、36h。收集细胞上清液，采用酶联免疫吸附法（ELISA法）检测细胞上清液PGE2和COX-2，严格按照试剂盒说明书要求进行操作。实验重复3次。

2.5 统计学方法 应用SPSS Statistics 17.0软件包处理，计量资料呈正态分布，用均数和标准差表示（x±s），多组间比较用单因素方差分析（One-way ANOVA），方差齐性时多组间两两比较用最小极差法（LSD法），方差不齐时多组间两两比较用Dunnett's T3法。以P＜0.05为有差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组荷瘤小鼠TGF-β1刺激后脾脏单个核细胞分泌PGE2含量比较 各组PGE2分泌量均呈先高后低，24h含量高于12h和36h，差异有统计学意义（P＜0.05），12h与 36h差异无统计学意义（P＞0.05）。各给药组PGE2含量均高于空白对照组（P＜0.01）。塞来昔布组与三叶青黄酮各剂量组PGE2均低于模型组（P＜0.01）。三叶青黄酮各剂量组PGE2含量高于塞来昔布组（P＜0.01）。三叶青黄酮高剂量组＜中剂量组＜低剂量组，高剂量组与中、低剂量组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表 1。

3.2 各组荷瘤小鼠TGF-β1刺激后脾脏单个核细胞分泌COX-2含量比较 各组COX-2分泌含量均呈先高后低，24h含量高于12h和36h，差异有统计学意义（P＜0.05），12h与36h差异无统计学意义（P＞0.05）。各给药组COX-2含量均高于空白对照组（P＜0.01）。塞来昔布组与三叶青黄酮高、中剂量组的COX-2均低于模型组（P＜0.01）。三叶青黄酮各剂量组COX-2含量均高于塞来昔布组高（P＜0.01）。三叶青黄酮高剂量组＜中剂量组＜低剂量组，高剂量组与低剂量组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

4 讨论

TGF-β1是一种多功能的多肽类细胞因子，它在肿瘤的发生、发展过程中有双重作用。在正常细胞中，TGF-β1通过阻断细胞从G1期进入S期而抑制细胞增殖、诱导分化或诱发凋亡。因此，在肿瘤发生的早期阶段，可阻止肿瘤细胞的增殖。但在肿瘤发展后期，该信号通路发生异常改变或功能缺陷，导致细胞不受细胞增殖的调控。

前列腺素 E2（prostaglandin E2，PGE2）是细胞膜磷脂代谢产物花生四烯酸（AA）在环氧化酶COX-1、COX-2和PGE2合成酶的作用下产生的脂质小分子，它促进肿瘤生长、血管生成和肿瘤细胞迁移。它还对免疫细胞有明显的抑制作用，如下调炎症趋化因子和Th1型细胞因子的产生，抑制树突状细胞的分化，抑制T细胞的增殖，抑制效应性T细胞抗肿瘤的作用[9]。环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）是可诱生型酶，静息细胞内检测不出，其表达高度受限。但可以被细胞内外广泛的刺激因素所诱导，这些刺激因素包括胃泌素、生长因子、IL-8、表皮生长因子、TNF-α及肿瘤诱导剂或紫外线照射等。COX-2的具体功能目前尚不清楚，在正常生理情况下，它可能参与生殖和分娩等过程；在病理情况下，COX-2可能参与炎症及肿瘤的形成[10]。

表1 各组荷瘤小鼠TGF-β1刺激后脾脏单个核细胞分泌PGE2含量比较

表1 各组荷瘤小鼠TGF-β1刺激后脾脏单个核细胞分泌PGE2含量比较

注：与空白对照组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.01；与塞来昔布组比较，#P＜0.01；与 12h、36h 比较，▲P＜0.05；与三叶青黄酮高剂量组比较，□P＜0.05

组别空白对照组模型组塞来昔布组三叶青黄酮高剂量组三叶青黄酮中剂量组三叶青黄酮低剂量组孔数333333 12h 94.61±4.63 125.66±4.27*107.91±2.75*△113.13±2.07*△#116.50±4.50*△#□119.21±2.04*△#□24h 99.31±3.82 138.18±4.00*▲110.13±2.38*△▲118.18±1.96*△#▲121.62±4.44*△#▲□128.90±4.24*△#▲□36h 94.41±2.78 126.01±4.04*107.22±2.53*△115.17±1.86*△#118.67±4.67*△#□121.59±6.21*#□

表2 各组荷瘤小鼠TGF-β1刺激后脾脏单个核细胞分泌COX-2含量比较

表2 各组荷瘤小鼠TGF-β1刺激后脾脏单个核细胞分泌COX-2含量比较

注：与空白对照组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.01；与塞来昔布组比较，#P＜0.01；与三叶青黄酮高剂量组比较，□P＜0.05；与 12h、36h 比较，▲P＜0.05

组别空白对照组模型组塞来昔布组三叶青黄酮高剂量组三叶青黄酮中剂量组三叶青黄酮低剂量组孔数333333 12h 283.59±5.34 322.63±6.22*305.46±2.69*△314.67±1.82*△#317.53±2.62*△#319.11±4.46*#□24h 290.49±5.37 331.58±5.78*▲309.51±2.85*△▲319.64±2.29*△#▲323.92±2.61*△#▲327.07±4.53*#□▲36h 285.79±5.53 326.51±5.78*303.60±2.24*△316.07±2.52*△#321.31±2.70*△#323.19±2.95*#□

三叶青，学名三叶崖爬藤，拉丁名tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg，为葡萄科崖爬藤属植物，是我国特有的植物[11]。具有清热解毒、祛风化痰、活血止痛的功能，在民间三叶青还被用于治疗肿瘤，被许多民间验方收载[12]。丁钢强等[12]研究发现，三叶青可以使小鼠体内TNF-α、IFN-γ含量增高，还能增强单核-巨噬细胞吞噬功能。TNF-α具有明确的体内外杀伤肿瘤细胞的作用[13-14]，TNF-α诱导的肿瘤细胞杀伤作用是通过其诱导细胞凋亡实现的。马丹丹等[15]研究显示，三叶青多糖有明显的抗肝损伤效果。利用有机溶剂萃取的方式提取三叶青后，黄酮类是应用价值最高的有效成分，其次还有多糖类物质、甾类化合物、有机酸、酯类化合物等。郝皖蓉[16]研究发现，高剂量（100mg/mL）的三叶青黄酮通过体内实验能下调荷肺癌鼠外周血及脾脏单个核细胞中的Treg细胞比例。

为进一步研究三叶青黄酮对脾脏单个核细胞的体外作用，预实验结果表明，正常小鼠脾脏单个核细胞也会分泌PGE2，且24、48、72h 3个时间点无明显差异，含量较平稳。TGF-β1作为肿瘤微环境中的细胞因子，在一定浓度下（5ng/mL）能刺激脾脏单个核细胞分泌PGE2增多，但以24h PGE2含量最高。本研究结果显示，荷Lewis肺癌小鼠因肿瘤发生微环境变化，使TGF-β1增多，推测其浓度增大到达一定程度时激发炎症通路，使PGE2、COX-2含量明显较空白对照组增高（P＜0.01）。

各药物干预组PGE2、COX-2与模型组相比均有下降（P＜0.01），三叶青黄酮各组中以三叶青黄酮高剂量组PGE2、COX-2下降最显著，说明作用与其浓度呈正相关。推测三叶青作为清热解毒的代表中药，能减少肿瘤相关炎症因子的含量，逆转PGE2/COX-2通路，改善肿瘤微环境，为逆转肿瘤免疫抑制提供了实验依据。

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Effect of Flavonoid Extract from Radix Tetrastigme on PGE2 and COX-2 in Spleen Mononuclear Cells of Lewis Lung Carcinoma Mice

ZHANG Qiqing,FENG Zhengquan.

Department of Oncology,Tongde Hospital of Zhejiang Province,Hangzhou(310012),China

ObjectiveTo investigate the effect of flavonoid extract of Radix Tetrastigme on the Expression of prostaglandin 2（PGE2） and cyclooxygenase-2（COX-2） in spleen mononuclear cells of mice with lung cancer.MethodsLewis lung carcinoma model was established with subcutaneous inoculation and the spleen was obtained after 14 days to isolate mononuclear cells,than were divided into model group（with TGF-β1 stimulation）,positive group（with celebrex）,low-,medium-,and high-dose flavonoid extract of Radix Tetrastigme groups,and blank group.ELISA was used to determine the contents of PGE2 and COX-2.ResultsAfter 24-h TGF-β1 stimulation,compared to blank group（PGE2:99.31±3.82pg/mL,COX-2:290.49±5.37pg/mL）,the contents of PGE2 and COX-2 in other 5 groups increased with a significant difference（P＜0.01）.The highest level of PGE2 and COX-2 was in model group（138.18±4.00pg/mL and 331.58±5.78pg/mL,respectively）.Compared with model group,the contents of PGE2 and COX-2 in drug groups were significantly reduced（P＜0.01）.The PGE2 level in celebrex group and high-,medium-,and low-dose flavonoid extract of Radix Tetrastigme groups were as follows:110.13±2.38pg/mL,118.18±1.96pg/mL,121.62±4.44pg/mL,and 128.90±4.24pg/mL;the COX-2 level were the following:309.51±2.85pg/mL,319.64±2.29pg/mL,323.92±2.61pg/mL and 327.07±4.53pg/mL;siginifcant difference was found among drug groups（P＜0.05 or P＜0.01）.ConclusionFlavonoid extract of Radix Tetrastigme can improve the tumor microenvironment by regulating the expression of PGE2 and COX-2 to against the tumor in a dose-dependent manner.

Lewis lung cancer mice;flavonoid extract of Radix Tetrastigme;mononuclear cell;cyclooxygenase-2;prostaglandin 2

项目来源：浙江省自然科学计划项目（No.Y12H270055）；国家中医药管理局中医药科技计划项目（No.JDZX2015251）

浙江省立同德医院肿瘤科（杭州 310012）

冯正权，E-mail：fzhq213@163.com

（收稿：2017-04-26 修回：2017-06-20）