姜黄素对溃疡性结肠炎模型小鼠结肠组织TNF-α、IL-1β、IL-10表达的影响

徐 磊沈 雁钟继红王章流郑华君郭飘婷

姜黄素对溃疡性结肠炎模型小鼠结肠组织TNF-α、IL-1β、IL-10表达的影响

徐 磊1沈 雁1钟继红1王章流1郑华君1郭飘婷2

目的 观察姜黄素对溃疡性结肠炎（UC）模型小鼠结肠组织肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）和白细胞介素10（IL-10）表达的影响，探讨其治疗UC的可能作用机制。方法SPF级健康雄性BALB/c小鼠60只，随机分为正常对照组、模型组、姜黄素组、柳氮磺胺吡啶（SASP）组，各15只。采用右旋葡聚糖硫酸钠（DSS）法复制UC小鼠模型，腹腔注射相应药物，连续7天。观察小鼠一般生理状态，疾病活动度指数（DAI）评分。末次给药后处死小鼠，行结肠大体形态损伤指数（CMDI）评分，组织切片染色，光镜下观察结肠组织的病理学变化并评估组织损伤指数（TDI）。ELISA法检测小鼠结肠组织促炎因子TNF-α、IL-1β和抗炎因子IL-10表达水平。结果（1）模型组小鼠大体形态、组织病理均符合溃疡性结肠炎特点。（2）各组DAI评分比较：SASP组[（0.51±0.40）分]、姜黄素组[（0.52±0.36）分]与模型组[（1.38±0.61）分]比较，P＜0.01。（3）各组CMDI评分比较：SASP组[（2.14±0.92）分]、姜黄素组[（2.19±1.10）分]与模型组[（3.83±1.44）分]比较，P＜0.01。（4）各组TDI评分比较：SASP组[（5.48±1.01）分]、姜黄素组[（6.48±1.03）分]与模型组[（8.89±0.88）分]比较，P＜0.01。（5）各组小鼠结肠组织TNF-α、IL-1β及IL-10含量比较：SASP组[（126.75±6.16）pg/mL、（157.51±20.43）pg/mL、（156.33±16.51）pg/mL]、姜黄素组[（254.83±28.29）pg/mL、（236.83±25.21）pg/mL、（136.66±16.49）pg/mL]与模型组[（418.19±41.67）pg/mL、（401.11±35.32）pg/mL、（33.96±6.68）pg/mL]比较，P＜0.01。结论 姜黄素可以显著改善UC小鼠症状、病理形态，上调小鼠结肠组织IL-10表达水平，抑制TNF-α、IL-1β表达水平，达到对UC的抗炎作用。

BALB/c小鼠；溃疡性结肠炎；姜黄素；细胞因子

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）发病机制尚不十分明确，目前普遍认为是环境因素作用于遗传易感者，在肠道菌群的参与下，肠腔内各种抗原通过缺损的肠黏膜屏障发生易位并暴露于黏膜固有层的免疫系统，启动肠道天然免疫及获得性免疫反应，导致肠黏膜屏障损伤、溃疡、炎性增生等病理改变[1-3]。促炎细胞因子 [如结肠组织肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素 1β（IL-1β）等]与抑炎细胞因子[如白细胞介素10（IL-10）等]之间的平衡失调可能是UC患者及动物模型发病的关键。姜黄主产于浙江温州瑞安一带，性寒，味辛，苦，入心、肝、胆经，具有破血行气，通经止痛之功效[4]。姜黄素是姜黄醇提物中的主要活性成分，其安全性高，价格低廉，具有抗炎、抗氧化、免疫调节、抗肿瘤等广泛药理作用[5-9]。研究显示，姜黄素对UC有确切的作用[10-12]，但对UC结肠组织细胞因子表达影响的研究报道较少。基于上述研究，拟应用右旋葡聚糖硫酸钠（dextran sulphate sodium，DSS）诱导UC小鼠模型，观察各组小鼠一般生理状态、疾病活动度指数（disease activity index，DAI）、结肠大体形态损伤指数（colon macroscopic damage index，CMDI）、组织损伤指数（tissue damage index，TDI），评价姜黄素对该模型的治疗作用及其对TNF-α、IL-1β和IL-10表达水平的影响，探讨姜黄素防治UC的可能机制。

1 材料与方法

1.1材 料

1.1.1 实验动物 健康雄性SPF级BALB/c小鼠60只，鼠龄 8 周，体质量（20±2）g，购自中国科学院上海实验动物中心，动物合格证编号：SCXK（沪）2013-0006。

1.1.2 主要药品与试剂 右旋葡聚糖硫酸钠（dextran sulphate sodium，DSS）购自Sigma-Aldrich公司（批号：31404，Fluka：5000MW）；姜黄素购自 Sigma-Aldrich 公司（批号：78246，分子量：368.38）；柳氮磺胺吡啶（salazosulfapyridine，SASP）购自 Sigma-Aldrich公司（批号：1636005，分子量：398.39）；TNF-α、IL-1β和IL-10 ELISA试剂盒（均购自Sigma-Aldrich公司，批号：RAB0489、RAB0489、RAB1060）。

1.1.3 主要仪器 石蜡切片机（德国Leica公司）；BX20型荧光显微镜摄像机（日本OLYMPUS公司）；GNP-9080型隔水式恒温培养箱（中国上海精宏医疗设备有限公司）。

1.2方法

1.2.1 药物混悬液配制[13-14]根据正常成人临床用量及人-小鼠体表面积换算，姜黄素及SASP分别溶于25mL/L的乙醇中配成所需浓度的混悬液（均为30mg/kg的剂量溶于25mL/L的乙醇 1000μL），4℃保存备用。

1.2.2 实验分组 将BALB/C小鼠60只按随机数字表法分成正常对照组、模型组、姜黄素组、柳氮磺胺吡啶组，每组15只，饲养环境22℃±1℃恒温，50%±10%恒湿饲养，保持光照/黑暗时间，每12h一循环，适应性饲养1周。

1.2.3 UC模型制备及鉴定[15]采用右旋葡聚糖硫酸钠法制备UC模型，具体方法参照文献报道并略有改进[16]：准确配制5%DSS溶液（5mg DSS溶于100mL蒸馏水），正常对照组小鼠每日自由饮用纯净水100mL，其他各组小鼠每日自由饮用5%DSS溶液，连续2周。造模结束后第2天各组随机处死小鼠各1只，观察结肠充血水肿情况；结肠组织HE染色，观察黏膜充血、水肿、糜烂、溃疡等的形成及炎症细胞浸润，确定模型是否成功。

1.2.4 药物治疗 自造模成功次日起，全部小鼠改为正常饮水，姜黄素治疗组和SASP治疗组以相应混悬液（均为30mg/kg的剂量溶于25mL/L的乙醇1000μL）每日腹腔注射，模型对照组每日腹腔注射与治疗组等体积的乙醇溶液，各组均1天1次，连续7天。

1.2.5 一般生理状态观察及疾病活动度评分 自造模之日起，每日观察并记录小鼠精神状态、进食、饮水和活动、体毛、粪便性状等情况。每日定时称量小鼠体质量，便隐血检测试纸（四甲基联苯胺法）检测每组小鼠的粪便隐血，试纸反应区任何位置出现蓝绿色，均视为阳性结果。并参照文献[17]行疾病活动度评分（DAI），DAI=体质量下降分数+大便性状分数+隐血程度分数/3。

1.2.6 结肠组织大体形态学检测 药物治疗结束后，小鼠用10%水合氯醛麻醉，开腹，严格无菌条件下取出结肠组织，对比各组结肠长度及外观改变，之后沿肠系膜纵行切开，用冰PBS冲洗干净，滤纸吸干水分后，观察结肠黏膜溃疡、糜烂、增生等情况，并参照文献[18]行大体形态损伤指数评分（CMDI）。

1.2.7 结肠组织病理学检测 距肛门1cm以上取4～6cm病变肠管组织（或依病变部位而定），修整后大小约1.0cm×1.0cm×0.2cm，置于包埋盒于4%多聚甲醛固定24h，石蜡包埋，3～4μm厚，连续切片，HE染色后光镜观察组织形态学变化，并参照文献[19]行组织损伤指数评分（TDI）。

1.2.8 结肠组织中细胞因子含量检测 剪取各组结肠组织并称重，每50mg加1mL PBS，在液氮条件下研碎，4℃ 3500r/min离心15min，取0.1mL上清液，按ELISA试剂盒说明书步骤测定TNF-α、IL-1β及IL-10的水平。

1.2.9 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件分析，计量资料以（x±s）表示，组间多重比较采用SNK法（student-newman-keuls法），以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠一般情况比较 治疗期间各组均无小鼠死亡。模型组从第3天开始，小鼠均出现不同程度体质量下降，精神呆滞、行动缓慢、体毛凌乱黯淡、进食减少、排便次数增多，糊状便，症状逐步加重，严重者出现肉眼血便。姜黄素组和SASP组小鼠体质量也相对下降但趋势较平缓，稀便、血便程度较模型对照组明显偏轻，且姜黄素组小鼠DAI评分较模型组显著下降（P＜0.01），见表 1。

2.2 小鼠结肠组织大体形态比较 肉眼可见，模型组小鼠结肠部位有明显的糜烂、溃疡灶、出血点，肠壁显著变薄，内容物较稀，部分黏膜脱落。姜黄素组和SASP组小鼠结肠大体形态明显改善，未发现有溃疡结节，肠内容物较黏稠。姜黄素治疗组CMDI评分显著优于模型组（P＜0.01），见表 2。

表1 各组小鼠治疗前后DAI评分比较

注：与模型组比较，*P＜0.01；DAI：疾病活动度指数；SASP：柳氮磺胺吡啶

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2.3 小鼠结肠组织病理改变 镜下可见，模型组结肠黏膜广泛溃疡，组织充血、水肿明显，部分肠壁凹陷，黏膜上皮细胞排列紊乱、破裂损伤，细胞核聚集、模糊，伴有较显著的细胞脱落，肠绒毛残损，组织内见大量炎性细胞浸润，以中性粒细胞为主；姜黄素组和SASP组结肠黏膜溃疡较少并可见已愈合的溃疡组织，组织水肿明显减轻，黏膜上皮细胞较整齐，细胞破裂减少，组织内炎性细胞浸润明显减少。空白对照组镜下可见结肠黏膜完整、光滑，腺体层次清晰可见，未见糜烂、溃疡及中性粒细胞浸润等。姜黄素组TDI评分显著优于模型对照组（P＜0.01），见表2、图1（插页）。

表2 各组小鼠CMDI及结肠黏膜TDI评分比较

表2 各组小鼠CMDI及结肠黏膜TDI评分比较

注：与模型组比较，*P＜0.01；CMDI：结肠大体形态损伤指数；TDI：组织损伤指数；SASP：柳氮磺胺吡啶

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2.4 各组小鼠结肠组织TNF-α、IL-1β及IL-10含量比较 姜黄素和SASP治疗后，小鼠结肠组织TNF-α、IL-1β 含量较模型组均明显下降（P＜0.01）；各治疗组小鼠结肠组织IL-10含量均明显高于模型组（P＜0.01），见表 3。

表3 各组小鼠结肠组织TNF-α、IL-1β及 IL-10含量比较

表3 各组小鼠结肠组织TNF-α、IL-1β及 IL-10含量比较

注：与模型组比较，*P＜0.01；TNF-α：肿瘤坏死因子 α；IL：白细胞介素；SASP：柳氮磺胺吡啶

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3 讨论

UC病变主要限于大肠黏膜层和黏膜下层，表现为反复发作的腹泻、黏液脓血便及腹痛，可并发中毒性巨结肠、穿孔、大出血、大肠癌等。病情迁延不愈，有终生复发倾向，已被WHO确认为现代难治病之一[20-22]。目前UC的常用治疗药物包括水杨酸类、糖皮质激素和免疫抑制剂，长期服用副作用较大，生物制剂价格昂贵，不适于临床广泛应用。

基于促炎因子和抗炎因子在UC发病中的重要角色及姜黄素的药理作用，本实验成功构建了与人类UC相似的DSS所致的小鼠模型，研究结果显示，姜黄素能有效改善UC小鼠稀便、便血、体质量下降等临床表现，明显降低其DAI、CMDI和TDI评分（P＜0.01），表现出良好的临床疗效；DSS诱导后小鼠结肠组织TNF-α、IL-1β含量明显升高，IL-10含量降低，而经姜黄素干预治疗后TNF-α、IL-1β水平均较模型组显著降低，IL-10水平显著升高，差异有统学意义（P＜0.01），表现出明确的促炎-抗炎细胞因子平衡的调控作用和抑制结肠急性炎症反应的作用。

研究结果表明，姜黄素能有效治疗DSS诱导的结肠炎可能与其非选择性地抑制结肠组织TNF-α和IL-1β、促进IL-10的表达有关。在此基础上，应继续研究TNF-α、IL-1β和IL-10等细胞因子上游的信号转导通路，为临床提供新的治疗靶标和更为有效的药物。

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Effect of Curcumin on the Expression of TNF-α,IL-1βand IL-10 of Colon Tissue of Mice with Ulcerative Coliti

XU Lei1,SHEN Yan1,ZHONG Jihong1,WANG Zhangliu1,ZHENG Huajun1,GUO Piaoting2

1 Department of Gastroenterology,the Second Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310005),China;2 Department of General Medicine,the Second Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310005),China

ObjectiveTo investigate the effects of curcumin on the expression of tumor necrosis factor α（TNF-α）,interleukin 1β（IL-1β） and interleukin 10（IL-10） in colon tissue ofmice with ulcerative colitis（UC）,and to explore the possible underlying mechanism.MethodsSixty SPF grade healthy BALB/c mice were randomly divided into four groups:blankgroup,model group,curcumintreatmentgroup,salazosulfapyridine（SASP） group.UC model was established by dextran sulphate sodium,and then daily intraperitoneal injected with the corresponding drugs for 7 days.During the course of experiment,the general conditions of mice were observed,and disease activity index（DAI） were assessed.At the end of treatment,colon tissue was dissected to evaluate the macroscopic damage index（CMDI） and tissue damage index（TDI） by light microscope and to determine the expression of TNF-α,IL-1β and IL-10 by ELISA.ResultsGeneral morphology and histopathology of the model group conforms to the manifestations of ulcerative colitis.The DAI score in SASP group,curcumin group was significant different compared with that in model group（0.51±0.40,0.52±0.36 vs 1.38±0.61,P＜0.01）.The CMDI score was statistically difference among model group,SASP group,andcurcumin group（3.83±1.44,2.14±0.92 and 2.19±1.10,P＜0.01）.The TDI score was decreased in SASP group and curcumin group compared to model group（5.48±1.01,6.48±1.03 vs 8.89±0.88,P＜0.01）.The contents ofTNF-α,IL-1βand IL-10 in colon tissue in model group（418.19±41.67pg/mL,401.11±35.32pg/mL,33.96±6.68pg/mL） also had significant difference compared with those in SASP group（126.75±6.16pg/mL,157.51±20.43pg/mL,156.33±16.51pg/mL） and curcumin group（254.83±28.29pg/mL,236.83±25.21pg/mL,136.66±16.49pg/mL）,with all P＜0.01.ConclusionCurcumin can significantly improve the symptoms and pathological morphology of UC mice by regulating the expression of IL-10 and inhibiting the expression of TNF-α and IL-1β,through which achieving the anti-inflammatory effect of UC.

BALB/c mice;ulcerative colitis;curcumin;cytokine

浙江中医药大学校级科研基金重点项目（No.2015ZZ07）

1浙江中医药大学附属第二医院消化内科（杭州 310005）；2浙江中医药大学附属第二医院全科医学科（杭州 310005）

徐磊：Tel：15968158441；E-mail：supershilling@sina.cn

（收稿：2017-02-05 修回：2017-05-31）