甲胎蛋白异质体在原发性肝癌临床诊断中的应用*

肖 潇，何羽童，房 萌，季 君，高致远，杨 园，高春芳

甲胎蛋白异质体在原发性肝癌临床诊断中的应用*

肖 潇，何羽童，房 萌，季 君，高致远，杨 园，高春芳

目的通过临床大样本数据回顾性分析血清甲胎蛋白（AFP）和甲胎蛋白异质体（AFP-L3）诊断原发性肝癌（PLC）的价值。方法2015年1月～2015年12月东方肝胆外科医院诊治的PLC患者7097例，同期诊治的肝硬化（LC）患者122例。采用化学发光法检测血清AFP水平，采用凝集素捕获微量离心柱法检测AFP-L3，将AFP-L3/AFP比值大于10%定义为AFP-L3阳性。结果7097例PLC患者血清AFP水平为61.7（5.4，1226.0）μg/L，显著高于 122 例 LC 患者的 3.6（2.5,10.95） μg/L（P＜0.05），AFP-L3阳性率为 8.2（-，26.1）%，而在肝硬化患者未检出AFP-L3阳性（P＜0.05）；以血清AFP≥20 μg/L或/和AFP-L3≥10%任一阳性为截断点，诊断PLC的准确度为63.1%，优于AFP（60.3%）和AFP-L3（47.9%）单独诊断的结果；AFP-L3阳性率随着AFP水平的升高而升高；血清AFP阴性的PLC和AFP阳性的LC患者AFP-L3阳性率分别为39.6%和7.7%，显著低于血清AFP阳性PLC患者的73.7%（P＜0.05）；在2103例具有病理学诊断的PLC患者，1976例肝细胞癌（HCC）患者血清AFP水平为50.8（4.8，1015.0）μg/L，6例混合型肝癌患者血清AFP水平为74.9（4.55，39248.3）μg/L，AFP-L3阳性率分别为5.3（-，24.6）%和 8.4（-，18.8）%，均显著高于 121 例肝内胆管细胞癌患者【2.8（2.2，5.15） μg/L，P＜0.05】和【-（-，-）%，P＜0.05】。结论大样本的结果显示PLC患者血清AFP和AFP-L3存在较高的阳性率，其诊断效能较好。

原发性肝癌；甲胎蛋白；甲胎蛋白异质体；诊断

作者单位：200438上海市 第二军医大学东方肝胆外科医院实验诊断科

原发性肝癌（primary liver cancer，PLC）在世界恶性肿瘤中位居第五位[1]，在我国肝癌病死率更是居于男性恶性肿瘤的首位[2]。该病早期缺乏特异性表现易被漏诊，但起病缓慢，侵袭性强，预后极差。因此，早期发现对于疾病诊断、治疗、预后都有重要意义[3]。目前，甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）是检测PLC患者的主要血清指标，但慢性肝炎，肝硬化（LC）、妊娠期妇女血清AFP也会升高。所以，其灵敏度和特异度并不十分高[4]。研究发现，肝脏疾病往往伴随多种蛋白的异常糖基化[5]，根据与小扁豆素（lens culinaris agglutinin，LCA）亲和力的不同可将AFP糖蛋白分为LCA非结合型AFP-L1、弱结合型AFP-L2和LCA结合型AFP-L3。将结合型AFP-L3称为AFP异质体，后者为一种异常糖基化的AFP，AFP-L3含量不受AFP总含量的影响，不同性别和年龄患者其含量也无显著性差异，但与PLC发生密切相关，成为新一代具有典型性的肿瘤标志物[6]。虽然AFP-L3在临床已经应用多年，但其应用价值尚缺循证医学大数据证据的支持。本文主要通过大样本回顾性分析PLC和LC患者血清AFP和AFP-L3水平变化，特别研究了两者的相关性及其在不同病理学类型PLC患者的水平差异，以期客观地评价AFP-L3在临床诊断PLC患者方面的价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2015年1月～2015年12月本院住院治疗的PLC患者7097例，男性6011例，女性1086例；年龄 3～85岁，平均年龄（55.31±11.08）岁。LC患者122例，男86例，女36例；年龄18～85岁，平均年龄（53.93±12.56）岁。PLC的诊断结合临床、病理学检查、B超、CT、MRI检查进行，符合《原发性肝癌诊疗规范（2011年版）》修订的标准，剔除严重肾功能损害和肝脏外恶性肿瘤患者。HCC患者均未经过肝脏外科切除、肝动脉化疗栓塞、射频消融等相关治疗。LC的诊断则经临床资料和影像学检查综合分析。经手术治疗具有病理学诊断的病例2105例，包括HCC 1976例，ICC 121例，混合型肝癌6例，LC2例。

1.2 血清学测定 抽取空腹静脉血3 ml，3000 r/m离心10 min，分离血清，于6小时内完成AFP和AFP-L3检测。采用电化学发光法检测血清AFP水平（罗氏公司E601，AFP水平参考区间为0～20μg/L，大于等于20μg/L时为阳性。当AFP水平＞1210μg/L时，经稀释液稀释后再测）；利用亲和吸附原理检测血清AFP-L3（北京热景生物技术有限公司）。血清AFP-L3通过特异性结合预装在亲和吸附离心管中的亲和介质LCA，将洗脱的吸附液再用罗氏E601测定AFP水平（AFP-L3）以及处理前标本的AFP（总AFP）水平，计算AFP-L3%，计算公式为AFP-L3%=AFP-L3×2.5/总AFP×100%。依照说明书，当AFP-L3%≥10%判定为阳性。当总AFP＜10μg/L时，AFP-L3%为阴性。

1.3 统计学方法 应用SPSS 19.0统计软件进行数据分析。计量资料以（±s）或 M（IQR）表示，分别采用t检验、非参数检验，计数资料采用x2检验。绘制ROC曲线评价AFP和AFP-L3的诊断价值，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 PLC和LC患者血清AFP和AFP-L3水平的比较 与LC比，PLC患者血清AFP和AFP-L3水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05，表1）。

表1 两组血清AFP和AFP-L3【M（IQR）】水平比较

2.2 AFP与AFP-L3在PLC诊断中的效能评价 以LC为对照组，绘制AFP和AFP-L3诊断的ROC曲线，结果显示，AFP诊断PLC的ROC曲线下面积为0.763（95%CI 0.730～0.796），AFP-L3 诊断 PLC 的ROC 曲线下面积为 0.747（95%CI 0.718～0.776，图1）。以血清AFP=20 μg/L为截断点，其诊断PLC的灵敏度为60.03%，特异度为78.69%，准确度为60.34%；以血清AFP-L3=10%为截断点，其灵敏度为47.10%，特异度为96.72%，准确度为47.94%。当各自的截断点不变，即AFP≥20μg/L或AFP-L3≥10%任一阳性时，两者联合诊断PLC的灵敏度为62.84%，特异度为77.05%，准确度为63.08%（表2）。可见，AFP与AFP-L3任一阳性即诊断的准确度优于单一指标的诊断效能。

2.3 不同血清AFP水平患者血清AFP-L3阳性率比较（表 3） 在240例AFP阴性（AFP在10～20μg/L）的PLC患者中，AFP-L3阳性200例（39.6%）；在4259例AFP阳性（AFP＞20μg/L）的PLC患者中，AFP-L3阳性3142例（73.7%），两者比较差异有统计学意义（P＜0.05）。AFP-L3阳性率随着AFP水平的升高而升高；在96例AFP阴性（AFP在10～20μg/L）的LC患者中，AFP阳性率为2.2%，在26例AFP阳性（AFP＞20μg/L）的LC患者中，AFP-L3阳性2例（7.7%），两组差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.4 具有病理学诊断结果的患者血清AFP和AFP-L3水平分析 经过非参数检验，结果显示，HCC组与ICC组患者血清AFP水平和AFP-L3阳性率差异有统计学意义（P＜0.05）；混合型肝癌组与ICC组血清AFP水平和AFP-L3阳性率差异有统计学意义（P＜0.05，表 4）。

图1 血清AFP和AFP-L3诊断PLC的ROC曲线分析

表2 血清AFP和AFP-L3诊断PLC患者的效能（%）比较

表3 不同血清AFP水平患者AFP-L3阳性率（%）比较

表4 不同类型肝癌患者血清AFP【M（IQR）】和AFP-L3(%）比较

3 讨论

虽然原发性肝癌患者的病死率极高，但近年来由于治疗技术的提高，其总体生存率也有所提高，但5 a生存率仍不到10%[7]。肿瘤标志物在肿瘤的形成、发展过程中会不断变化，我们通过分子生物学、免疫学等方法对其进行检测，从而辅助诊断是否患有肿瘤并评价患者预后。临床上，AFP大于400μg/L常被认为高度提示PLC[8]，但数据证明病毒性肝炎、LC患者也会出现AFP水平的升高，干扰了对PLC的鉴别诊断。研究指出，AFP-L3阳性患者比血清AFP水平升高患者发展成为PLC的可能性更大[9]。我们对大样本数据经分层分析结果提示，随着AFP水平的升高AFP-L3阳性率也升高，进一步证明了AFP-L3辅助AFP诊断PLC的作用。我们的研究报道与文献报道中提示的随肿瘤临床分期提高和肿瘤增大AFP-L3阳性率也升高[10]相一致。AFP-L3对HCC疗效的监测也有着重要的意义[11]。本组2例LC患者血清AFP在10～20μg/L之间，AFP-L3异质体为阳性，结合该2例患者均为失代偿期，合并慢性胆囊炎，其中1例经MRI检查提示疑似存在门静脉栓子。2例患者经治疗，预后均差。对于AFP-L3阳性的患者更具有潜在的发生癌症的可能，更需注意后期随访[12]。有文献报道也称，AFP-L3＞10%可以作为肝癌的预警诊断[13]。

目前，ICC已是继HCC之后第二大原发性肝脏恶性肿瘤，约占PLC的5%～10%[14]。我们研究发现ICC患者AFP阴性者为93.4%（113/121），经病例资料查阅后核实AFP阳性的8例ICC患者中有6例术中查看肝脏存在子灶或门静脉癌栓，提示具有更强的转移性和侵袭性。所以，对于AFP阴性的PLC患者也不能忽视ICC的存在，如果AFP-L3阳性更应该警惕肿瘤转移和侵袭的可能。

AFP是一种由肝脏和卵黄囊合成的单链糖蛋白，作为PLC的首选诊断指标，仍有20%～40%的患者处于阴性状态[15]。血清AFP水平与细胞AFP的表达相关，往往取决于瘤体的大小。因此，有时候仅凭AFP的检测很难区别肝脏良性疾病与恶性肿瘤。AFP-L3阳性的PLC具有快速生长和早期转移的特征。对于AFP低水平，特别是微小肝癌患者，检测AFP-L3有助于早期诊断。通常，采用植物凝集素结合能力法对AFP-L3进行分离，然后应用化学发光法再定量测定，该方法操作简便[16]，但由于受到仪器灵敏度的限制，当血清AFP水平小于10μg/L时，将无法测定AFP-L3的比率。本组2333例患者血清AFP水平小于10μg/L而未进行AFP-L3测定，不排除其中存在阳性结果的可能。最新进入临床应用的微流控检测法已经将AFP-L3检测的灵敏度提高到血清AFP等于 0.3μg/L[17]，可对低水平AFP的PLC患者进行AFP-L3百分比分析，但目前国内尚缺乏应用的大数据。对于低水平AFP患者，这种超敏AFP-L3的检测方法是否能补偿一些不足尚有待进一步证实。

我国PLC特别是HCC的发生与HBV感染相关。近年来，随着乙肝疫苗免疫接种的普及，HBV感染率被有效降低，2006年我国1～59岁HBV携带率为7.18%，2014年中国疾病预防控制中心调查显示，1～4岁人群HBV感染率为0.32%，5～14岁感染率为0.94%，15～29岁人群感染率为4.38%[18]，与过去相比较已明显下降。而以代谢性异常为代表的非病毒性感染相关的PLC将逐渐上升，因此也应引起重视[19]。ICC的发生也呈现上升趋势[20]。因此，需加强对于AFP阴性PLC患者肿瘤标志物的研究，为辅助临床早期诊断及随访提供帮助。

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（收稿：2016-11-20）

（本文编辑：陈从新）

Diagnostic value of serum alpha-fetoprotein and lentil lectin-reactive alpha-fetoprotein in patients with primary livercancer

XiaoXiao，HeYutong，FangMeng，etal.DepartmentofMedicalLaboratory，Eastern Hepatobiliary Hospital，Second Military Medical University，Shanghai 200438，PR China

Objective To retrospectively analyze serum alpha-fetoprotein （AFP） and lentil lectin-reactive alpha-fetoprotein ratio（AFP-L3%） in the diagnosis of patients with primary liver cancer （PLC）.Methods A cohort of 7097 patients with PLC was recruited in Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital between January 2015 and December 2015.At the same period，122 patients with liver cirrhosis（LC） were enrolled.Serum AFP and AFP-L3 were detected by electrochemiluminescence and lectin microcentrifugalcolunm，respectively.The positivity of AFP-L3 was defined as the ratio of AFP to L3/AFP was higher than 10%.Results Serum AFP level in 7097 patients with PLC was 61.7（5.4，1226.0） μg/L，much higher than 3.6（2.5，10.95） μg/L（P＜0.05） in 122 patients with LC，and the AFP-L3 positivity was 8.2（-，26.1）%，significantly higher than in patients with LC as all were negative in the latter（P＜0.05）；the accuracy in diagnosis of PLC was 63.1%，higher than 60.3%by serum AFP or 47.9%by AFP-L3 alone when either of serum AFP≥20μg/L and/or AFP-L3≥10%as the cut-off-value；the positivity of AFP-L3 increased as serum AFP levels increased；the positivity of AFP-L3 in PLC patients with negative serum AFP and in LC patients with positive serum AFP were 39.6% and 7.7% ，respectively，both significantly lower than 73.7%（P＜0.05） in PLC patients with positive AFP；serum AFP levels and positivities of AFP-L3 were 50.8（4.8，1015.0） μg/L and 5.3（-，24.6）% in 1976 patients with histology-proven hepatocellular carcinoma （HCC），and 74.9（4.55，39248.3）μg/L and 8.4（-，18.8）%in 6 patients with histology-proven mixed hepatoma，both higher than【2.8（2.2，5.15）μg/L，P＜0.05】and【-（-，-）%，P＜0.05】in 121 patients with histologically diagnosed intrahepatic cholangiocarcinoma.Conclusion Our big data confirm again AFP and AFP-L3 have a higher positive rate in PLC，and its diagnostic value is good.

Hepatoma；Alpha-fetoprotein；Lentil lectin-reactive alpha-fetoprotein；Diagnosis

10.3969/j.issn.1672-5069.2017.05.015

国家自然科学基金资助项目（编号：81301516/81271925）；上海市科委基金资助项目（编号：15JC1404100）

肖潇，女，29岁，大学本科，技师。主要从事临床免疫学与检验学研究。E-mail:hsiao_33@163.com

共同第一作者：何羽童，女，21岁，大学本科，见习技师。主要从事临床分子生物学与检验学研究。E-mail:derahyt@163.com

高春芳，E-mail:gaocf1115@163.com