肝细胞癌组织miR-139水平及其靶基因功能的生物信息学分析*

梁 亮,张寅斌，昝 瑛，张 扬 ，张淑群

肝细胞癌组织miR-139水平及其靶基因功能的生物信息学分析*

梁 亮,张寅斌，昝 瑛，张 扬 ，张淑群

作者单位：710004西安市 西安交通大学第二附属医院肿瘤科

目的探讨肝细胞癌（HCC）组织miR-139水平及其临床意义，并对其潜在的靶基因进行生物信息学分析，为miR-139在HCC发病机制中的作用研究提供理论基础。方法通过分析国际癌症和肿瘤基因图谱（TCGA）HCC数据库，比较HCC组织与癌旁组织mir-139水平，分析不同临床和病理学（TNM）分期肿瘤组织mir-139水平差异及其与患者生存之间的关系。通过mirTarBase数据库获取经实验证实的miR-139靶基因，并利用DAVID生物信息数据库对miR-139靶基因进行Gene Ontology功能富集分析及Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes信号转导通路富集分析。结果HCC组织mir-139水平（143.12±117.55）显著低于癌旁组织【（486.48±145.18）g，P＜0.01】；随着TNM分期增加，癌组织mir-139水平呈逐渐下降趋势（I期、II期、III期、IV期分别为161±104、124.1±132.5、128±128.5、91.08±77.88，P＜0.01）；癌组织 mir-139 水平与 TNM 分期呈负相关（r=-0.2563，P＜0.001）；随着肿瘤T分期的增加，癌组织mir-139水平呈逐渐下降趋势（I期、II期、III期、IV期分别为159.8±101.8、121.3±129.2、135.3±131.5、72.57±48.52，P＜0.01），且肿瘤组织 mir-139 水平与 HCC T 分期呈负相关（r=-0.2586，P＜0.001），而与淋巴结转移（N分期）或远处转移（M分期）无显著性相关（均P＞0.05）；肿瘤组织mir-139水平与患者生存呈正相关，将癌组织mir-139水平由低到高分为4个区间，其中位生存时间分别为16.05 m、16.12 m、24.05 m 和24.19 m，组间差异具有统计学意义（Log-rank，P＜0.001）；miR-139靶基因功能主要富集于与启动子结合、RNA聚合酶II介导转录和细胞内信号通路传递等分子功能上，相关信号通路主要富集于各种肿瘤相关信号通路、B细胞受体信号通路、Ras信号通路和T细胞受体信号通路传递等。结论HCC组织miR-139水平降低，且与患者临床分期和生存呈负相关。miR-139靶基因功能显著富集于转录调节和肿瘤相关信号通路传递，提示miR-139在HCC的发生、发展中起到潜在的抑癌基因作用，并可能作为新的治疗靶点和预后标志物。

肝细胞癌；miR-139；癌症和肿瘤基因图谱；基因实体论

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是发生于肝脏的恶性肿瘤，在全世界范围内居恶性肿瘤发病率的第五位，且其发生率和死亡数呈逐年上升趋势[1，2]。HCC的发生大多与慢性肝病相关 ，包括病毒性肝炎、肝硬化、脂肪肝等[1]。HCC患者术后肿瘤的高复发率仍是威胁患者长期生存的主要因素。目前，对于无法实施手术的晚期HCC患者也尚无理想的治疗方案。因此，对HCC发生及复发的分子机制进行深入研究，寻找新的治疗靶点有着极其重要的临床和科学意义。MicroRNA（miRNA）通过与目标基因mRNA互补配对结合，调控靶基因的表达，在细胞分化、增殖和凋亡等方面发挥重要的作用，并参与肿瘤的发生、发展、转移和复发[3，4]。研究表明，多种miRNA在HCC的发病和转移过程中扮演着重要的角色，如 miR-9、miR-21和miR-139等[5-8]，其中miR-139在HCC发病中主要起到抑癌基因的作用，可以抑制HCC细胞增殖、侵袭和转移[7，9-11]。然而，就我们所知，这些研究均为基于细胞系的体外研究，miR-139在HCC组织中的表达，以及与临床转归之间的关系尚无研究成果发表。因此，本研究通过分析肿瘤基因图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库中HCC的病例，比较了HCC组织和癌旁肝组织miR-139水平差异，并进一步分析了其水平与肿瘤病理学分期和患者生存的关系。本研究还对miR-139的靶基因进行了生物信息学分析，系统性地研究了miR-139在HCC发病中的可能作用机制，为探索HCC发病的分子机制和寻找新的治疗靶点提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 HCC病例及其癌组织和癌旁组织miR-139水平资料的获取 自TCGA（http://cancergenome.nih.gov/）数据库下载有关HCC的临床资料和mir-139水平数据（miRNASeq 3级数据）。选择的数据集为Liver Hepatocellular Carcinoma（LIHC）。截至 2016年4月，该数据集包含了377例HCC患者和49例对照癌旁组织，其中全部377例HCC均有临床随访信息，372例有miRNA数据。因此，本研究选择有miRNA数据的372例样本进行数据分析。本研究符合TCGA发布的发表指导规范（https://cancergenome.nih.gov/publications/publicationguidelines）。

1.2 HCC组织和癌旁组织miR-139水平检测的方法 使用AllPrep RNA mini kit（Qiagen）试剂盒，采用TRIzol法提取组织总RNA，包括microRNA。采用Agilent Bioanalyzer检测提取的RNA质量，28S/18S比值≥1或RIN≥7的RNA被用于后续检测。采用Illumina hiseq 2000进行microRNA测序法得到miR-139及其他microRNA水平。

1.3 miR-139靶基因的生物信息学分析 通过mirTarBase数据库（http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/）获取经实验证实的miR-139的靶基因[12]。应用DAVID BioinformaticsResources6.7在线工具（https://david.ncifcrf.gov/）对miR-139靶基因进行Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）信号转导通路富集分析，采用Fisher Exact Test计算KEGG信号通路的P值，以P＜0.05为显著性阈值。应用DAVID对miR-139靶基因进行 Gene Ontology（GO）分子功能富集分析，以P＜0.01为显著性阈值。

1.4 数据分析 应用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计量资料以（±s）表示，肿瘤组织和癌旁组织miR-139水平的比较采用t检验，不同病理学分期和T分期HCC组织miR-139水平采用Kruskal-Wallis检验，miR-139水平与 HCC TNM分期或与T分期间的关系采用Spearman相关分析。采用Cox比例风险模型对肿瘤组织miR-139水平对患者预后的影响进行单因素回归分析，采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，应用对数秩和检验（Log-rank test）分析生存率差异，显著性检验水准为双侧 P＜0.05。

2 结果

2.1 HCC组织与癌旁组织miR-139水平比较 HCC组织miR-139水平为（143.12±117.55），显著低于癌旁组织的（486.48±145.18），两者差异具有统计学意义（P＜0.01，图 1）。

图1 HCC肿瘤组织与癌旁组织miR-139水平比较 HCC肿瘤组织miR-139水平显著低于癌旁组织（**P＜0.01）

2.2 不同TNM分期肿瘤组织miR-139水平比较 随着TNM分期增加，癌组织mir-139水平呈逐渐下降趋势（I期、II期、III期、IV 期分别为 161±104、124.1 ±132.5、128 ±128.5、91.08 ±77.88，P＜0.01，图2A）；癌组织mir-139水平与TNM分期呈负相关（r=-0.2563，P＜0.001，图 2B）。进一步分析发现，随着肿瘤T分期的增加，癌组织mir-139水平呈逐渐下降趋势（I期、II期、III期、IV 期分别为 159.8±101.8、121.3±129.2、135.3±131.5、72.57±48.52，P＜0.01，图2C），且肿瘤组织mir-139水平与HCC T分期呈负相关（r=-0.2586，P＜0.001，图 2D），而与淋巴结转移（N分期）或远处转移（M分期）无显著性相关（图2E和图2F，均 P＞0.05）。

2.4 miR-139靶基因的生物信息学分析 检索miRTarBase数据库，获取88个经实验证实的miR-139靶基因。利用DAVID数据库对这些靶基因进行GO功能富集分析和KEGG信号转导通路富集分析。经统计学分析表明，按主要的GO富集度功能分类，miR-139靶基因主要参与启动子结合、RNA聚合酶II介导的转录和细胞内信号通路传导等（P＜0.01，表1）；对靶基因进行 KEGG 信号通路分析，发现miR-139靶基因主要涉及的信号通路主要富集于各种肿瘤相关信号通路、B细胞受体信号通路、Ras信号通路和T细胞受体信号通路传导等（P＜0.01，表 2）。

图2 HCC癌组织mir-139水平与TNM分期的相关性（**P＜0.01）

2.3 肿瘤组织mir-139水平与患者生存的关系 随访所有患者0～120.8个月，中位随访时间为19.8个月。将HCC组织mir-139水平分为4个区间（由低到高为Q1～4），并计算每个区间组患者的生存时间。生存分析结果显示，肿瘤组织mir-139水平与患者生存呈正相关，即肿瘤组织miR-139高水平患者生存时间显著长于低水平者（中位生存时间 Q1～Q4分别为 16.05 m、16.12 m、24.05 m 和24.19 m），组间差异具有统计学意义（Log-rank P＜0.01，图 3）。

图3 HCC肿瘤组织mir-139水平与HCC患者生存的关系

表1 实验证实的 miR-139靶基因调节的GO细胞功能

表2 实验证实的 miR-139靶基因的KEGG信号通路分析

3 讨论

HCC的发生大多与前期的慢性肝病相关[13]。70%～85%原发性肝癌属于HCC[14]。miRNA作为内源性小分子RNA，广泛参与生物体内的多种生物学过程，如发育的进程、干细胞分化、细胞凋亡以及肿瘤发生等[15，16]。miR-139 在多种肿瘤，包括 HCC，水平下降，造成肿瘤细胞的增殖、迁移及转移[17-19]。Qiu et al[7]报道miR-139通过下调ZEB1和ZEB2表达，抑制HCC细胞上皮细胞向间充质细胞转换、迁移及侵袭。Gu[10]报道miR-139通过调节WNT/TCF-4信号通路活性，从而抑制HCC细胞增殖和侵袭。Fan[9]报道miR-139下调c-Fos，抑制HCC细胞转移。Wong[11]报道 miR-139通过下调 Rock2，抑制HCC细胞转移和进展。然而，这些研究均为基于细胞系的体外研究，miR-139在HCC组织水平以及与临床转归之间的关系如何尚不清楚。美国政府发起的癌症和TCGA计划，利用大规模测序为主的基因组分析技术，最终完成了一套完整的与癌症基因组改变相关的“图谱”，为理解癌症发生发展的分子机制提供了基础数据，包括miRNA水平及患者基本临床信息等。本研究通过分析TCGA HCC数据库，发现miR-139在HCC组织水平显著低于癌旁组织，与细胞系数据相一致。随着TNM分期增加，HCC癌组织mir-139水平呈逐渐下降趋势，且mir-139水平与HCC TNM分期呈负相关。进一步分析发现，随着肿瘤T分期的增加，HCC癌组织mir-139水平呈逐渐下降趋势，且肿瘤组织mir-139水平与HCC T分期呈负相关，而与淋巴结转移（N分期）或远处转移（M分期）无显著性关系。生存结果分析显示，肿瘤组织mir-139水平与患者生存呈正相关。总之，这些结果提示miR-139在HCC发生发展过程中起抑制性作用，与细胞系结果一致。结合文献数据和本研究结果，我们认为miR-139在HCC的发病中起抑癌基因的作用，可能作为HCC新的诊断指标和治疗靶点。

正确认识miR-139与靶基因的相互作用，有助于对miR-139作用机制的理解。一个miRNA通常调控多个基因的表达，而同一基因也常受多个miRNA调控，这种调控方式导致miRNA功能的研究具有复杂性。生物信息学可对复杂的信息进行分析和处理，较为系统地研究某一miRNA的功能[20]。本研究通过mirTarBase数据库获取经实验证实的miR-139的靶基因共88个。对这些靶基因进行GO功能分析发现，按主要的功能分类，miR-139靶基因主要参与启动子结合、RNA聚合酶II介导的转录和细胞内信号通路的传导。对靶基因进行KEGG信号通路分析，发现miR-139靶基因涉及的信号通路主要富集于各种肿瘤相关信号通路、B细胞受体信号通路、Ras信号通路和T细胞受体信号通路等。生物信息学分析的结果为MiR-139在HCC发病中的功能提供了潜在的作用机制和进一步研究的理论依据。

因此，本研究揭示的miR-139在HCC发展进程中的作用及分子机制将有助于进一步了解HCC的发病机制，为以miR-139为靶点设计的反义核酸类药物治疗HCC提供理论依据。

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（收稿：2017-02-21）

（本文编辑：陈从新）

Implication of miR-139 in hepatocellular carcinoma and bioinformatics analysis of its perimentally validated targets genes

Liang Liang，Zhang Yinbin，Zan Ying，et al. Department of Oncology，Second Affiliated Hospital，Jiaotong University，Xi'an 710004，Shaanxi Province，China

Objective The aim of this study was to investigate the implication of miR-139 in hepatocellular carcinoma（HCC） and the bioinformatics analysis of its perimentally validated targets genes.Methods By analyzing the data of HCC in The Cancer Genome Atlas（TCGA） database，we compared the miR-139 levels in HCC tissues and its adjacent liver tissues and analyzed the association between miR-139 levels with pathological stages and survivals of patients.We also retrieved the experimentally validated target genes from the mirTarBase database，and the gene ontology（GO） and the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） pathway enrichment analysis were made.Results Levels of miR-139 in HCC tissues（143.12±117.55） was significantly lower than that in adjacent tissues【（486.48±145.18），P＜0.01】；The patients were stratified into 4 groups based on the levels of mir-139 and the median survival in each groups from low to high were 16.05 m，16.12 m，24.05 m and 24.19 m，respectively，and there was a significant difference among differentgroups （Log-rank，P ＜0.001）；Go function analysis revealed that miR-139 targetgenes were mainly regulating binding with promoters and intracellular signaling transduction and KEGG analysis indicated that these genes were mainly involved in cancer-related pathways，B and T cellreceptor signaling and Ras signaling pathway.Conclusion miR-139 levels is down-regulated in HCC and is negatively correlated with pathological stages and survival of patients（both P＜0.05）.Bioinformatics analysis suggest that miR-139 contributes to cancer development mainly through regulating gene transcription and cancer-related signaling pathways.The presentstudy indicatesthatmiR-139 plays an inhibitory role in formation and development of HCC.

Hepatoma；miR-139；The Cancer Genome Atlas；Gene ontology

10.3969/j.issn.1672-5069.2017.05.012

陕西省自然科学基金（编号：2016JM8126)

梁亮，女，36岁，博士研究生，主治医师。主要从事乳腺肿瘤内科治疗。E-mail:liangliangsxp@126.com

张淑群，E-mail:zhangshuqun1971@aliyun.com