红藻糖苷抑制黑色素形成的作用研究

翦秋丽, 蒋丽刚, 严江燕, 陈海敏

(1. 宁波大学 浙江省海洋生物工程重点实验室, 宁波 315211； 2. 珀莱雅化妆品股份有限公司, 杭州 310012)

红藻糖苷抑制黑色素形成的作用研究

翦秋丽1, 蒋丽刚2, 严江燕1, 陈海敏1

(1. 宁波大学 浙江省海洋生物工程重点实验室, 宁波 315211； 2. 珀莱雅化妆品股份有限公司, 杭州 310012)

探索红藻糖苷对生物体黑色素产生的抑制作用。利用黑素瘤细胞B16-F0评价红藻糖苷对细胞合成黑色素的影响；从抑制酪氨酸酶酶活角度研究其抑制机理。研究显示，红藻糖苷对黑素瘤细胞无明显细胞毒性，但呈浓度依赖性抑制细胞黑色素产生。红藻糖苷对酪氨酸酶的单酚酶和二酚酶活性都有抑制作用，单酚酶的IC50为89 mmol/L；对二酚酶的抑制为可逆竞争性抑制，Ki为16.44 mmol/L。可见，红藻糖苷具有抑制细胞生成黑色素的能力，其机理与抑制酪氨酸酶活性有关。

红藻糖苷；黑色素；酪氨酸酶；抑制

AbstractTo study the inhibitory effect of floridoside in red algae on the generation of melanin, the B16-F0 melanoma cells were used to evaluate the ability of floridoside on the biosynthesis of melanin. The effect of floridoside on the activity of tyrosinase was also detected for investigating the mechanism. Results indicated that floridoside showed no obvious toxicity to B16-F0 melanoma cells, but suppressed melanogenesis with the concentration dependence manner. Floridoside was discovered to inhibit both the monophenolase and the o-diphenolase activities. It influenced the steady state of monophenolase activity and IC50was 89 mmol/L. The inhibition on o-diphenolase activity was in a concentration dependent manner, and 40 mmol/L floridoside reduced the steady state activity for 33.08%. The inhibition kinetics analyzed by Lineweaver-Burk plots showed that floridoside was a reversible competitive inhibitor, and the inhibition constant was determined to be 16.44 mmol/L for the free enzyme. In general, floridoside was potential to suppress the generation of melanin, and the mechanism was to inhibit the activity of tyrosinase, especially the activity of o-diphenolase.

Keywordsfloridoside; melanin; tyrosinase; inhibition

酪氨酸酶是一种存在于人体中的含铜多酚氧化酶，是黑色素合成中的关键酶[1]。酪氨酸酶的异常表达会导致人体色素的沉着，产生如黄褐斑、雀斑和老年斑等问题，且与大脑中的神经黑色素形成及帕金森病有关[2]。因此，酪氨酸酶抑制剂的开发引起了广泛重视。近年来报道的一些抑制剂，如熊果甙[3]、VC衍生物[4]、曲酸[5]和中药萃取物[6]等已开发成为化妆品添加剂。而随着药妆品市场的发展，海洋天然产物的开发更受关注。

红藻糖苷(α-氧-甘油-α-D-半乳吡喃糖苷)是红藻中主要的光合可溶物质，在藻体内是重要的渗透压调节剂[7]，且红藻糖苷还具有很多生物活性，如调节免疫系统、抗氧化等[8-9]。但国内外关于红藻糖苷抑制黑色素形成的研究未见报道。因此，本文以B16-F0 黑素瘤细胞为模型，研究红藻糖苷对B16-F0 合成黑色素的影响，并从酪氨酸酶抑制的角度研究其作用机理。

1 材料与方法

1.1 材料

红藻糖苷，以坛紫菜为原料制备(自制)，制备及分析方法参考文献[10]，纯度≥95%。B16-F0黑素瘤细胞购自CCTCC(武汉，中国)；酪氨酸酶、L-3,4二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)及L-酪氨酸等购于Sigma公司。

1.2 黑色素细胞增殖抑制率测定

将B16-F0黑素瘤细胞培养于含10%小牛血清的MEM培养液中(37℃，5%CO2)。细胞毒测定采用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT法)。黑素瘤细胞存活率(%)=(样品平均吸光度值/空白组平均吸光度值)×100%。

1.3 黑色素抑制测定

将B16-F0细胞以105个/mL的密度接种于6孔板，培养12 h后加入不同浓度红藻糖苷或0.3 mmol/L曲酸作为阳性对照，3 d后，PBS洗涤，加入1 mL细胞裂解液，3000 r/min离心10 min后，弃上清，加含10% DMSO的1 mol/L NaOH溶液1 mL， 80℃溶解黑素颗粒，于475 nm下测吸光值[11]。

黑素合成抑制率(%)=[1-(样品孔吸光度值/样品孔细胞密度)/(空白孔吸光度值÷空白孔细胞密度)]×100%

1.4 酪氨酸单酚酶和双酚酶活力测定

在含0.02 mol/L磷酸缓冲液(pH 6.8)的体系中加入不同浓度的红藻糖苷，再加入底物，30℃保温5 min后加入酪氨酸酶溶液，振荡混匀，在30℃下测定475 nm的吸光值。单酚酶活力所用底物为2 mmol/L酪氨酸。二酚酶底物为1 mmol/LL-DOPA。检测吸光值随时间增长曲线的斜率得到酶活力，消光系数为ε=3700(mol/L·cm)-1。酶动力学参数通过Lineweaver-Burk双倒数作图得到，包括表观米氏常数(Km)和最大反应速度(Vm)[12]。

1.5 数据处理与分析

2 结果

2.1 红藻糖苷对黑色素瘤细胞合成黑色素的能力影响

首先对红藻糖苷的细胞毒性进行了检测，从结果看，红藻糖苷在检测浓度范围内对B16-F0黑素瘤细胞无细胞毒性。如浓度为2.4 mmol/L时，存活率在97%以上；而当浓度达到4 mmol/L时，存活率则有(103.30±3.85)%，见图1。

随后检测了红藻糖苷对B16-F0 细胞黑色素合成的抑制作用。图2显示，红藻糖苷呈浓度依赖性地抑制黑色素合成，浓度达到0.8 mmol/L后黑色素产生明显减少(P<0.05)，当浓度为3.0 mmol/L时，抑制率为37.71%(P<0.01)。而0.3 mmol/L曲酸的抑制率为47.58%(P<0.01)。

图1 红藻糖苷对B16-F0 细胞的存活率的影响

图2 红藻糖苷对B16-F0 细胞内黑色素生成的抑制

2.2 红藻糖苷对酪氨酸酶单酚酶活力的影响

图3-A中的曲线1为酪氨酸酶在不含红藻糖苷时的单酚酶进行曲线，开始时的产物形成量呈缓慢上升趋势，一定时间后则直线上升，反应体系达到恒定的斜率，说明反应达到了稳定态，而直线部分的斜率即为该酶的稳态活力。随着红藻糖苷浓度的增大，酪氨酸酶的稳态活力逐渐下降(图3-B)，其IC50为89 mmol/L，100 mmol/L的红藻糖苷使酶活力下降了57.15%。

图3 红藻糖苷对酪氨酸单酚酶进程曲线的影响

A：反应的进程曲线(曲线1-6的红藻糖苷浓度分别为0、20、40、60、80和100 mmol/L)；B：稳态酶活力曲线

2.3 红藻糖苷对酪氨酸酶二酚酶活力的影响

酪氨酸酶催化L-DOPA氧化的反应曲线见图4。加入红藻糖苷后，直线的斜率呈下降趋势，说明红藻糖苷对酪氨酸酶的二酚酶活力具有抑制作用。随抑制剂浓度增大，酶活力下降，40 mmol/L红藻糖苷可以使酶的稳态活力下降33.08%。

随后，固定L-DOPA浓度为1.0 mmol/L，改变加入的酶量，研究红藻糖苷对酶量与酶活力关系的效应。图5表明，直线斜率随红藻糖苷浓度的增大而下降，说明红藻糖苷对酪氨酸二酚酶的抑制作用是可逆的，红藻糖苷能通过抑制酪氨酸酶活，而不是降低酶量来使催化效率下降。

图4 红藻糖苷对酪氨酸酶二酚酶活力的影响

图5 红藻糖苷对酪氨酸酶抑制机理的判断

直线0～4分别代表浓度为0、2、4、6和8 mmol/L

2.4 红藻糖苷对酪氨酸酶二酚酶的抑制类型及抑制常数的测定

进一步研究了红藻糖苷对酪氨酸酶二酚酶的抑制作用，通过固定酶浓度，改变底物L-DOPA的浓度，来测定不同浓度红藻糖苷对酶活力的影响，以Lineweaver-Burk双倒数法作图(图6)，得到纵轴截距不变的一组直线，结果显示，红藻糖苷未改变酶促反应的最大反应速度(Vmax)，仅影响到米氏常数(Km)，发现Km随红藻糖苷浓度的增大而增大，表现出竞争性抑制方式。以不同浓度红藻糖苷下测到的Km对抑制浓度作图(图6内插图)，形成一条直线，从直线的斜率求得抑制常数为16.44 mmol/L。

图6 红藻糖苷对酪氨酸酶的抑制类型和抑制常数

直线0～4分别代表浓度为0、2、4、6和8 mmol/L

3 讨论

在黑色素的生物合成中酪氨酸酶扮演了重要的角色[1]，通过对酪氨酸酶的抑制，可以减少黑色素产生，作为化妆品添加剂开发，可以达到美白效果。目前已应用于化妆品的酪氨酸酶抑制剂有VC衍生物、中药提取液、曲酸等，这些物质会存在不稳定、皮肤刺激、易变质等问题。宋康康等[3]曾报道了一种天然葡萄糖苷——熊果苷，具有良好的酪氨酸酶抑制作用，目前已在日本被用于化妆品的美白添加剂；章思思等[13]也报道，氨基葡萄糖有良好的酪氨酸酶抑制作用。有报道指出，羟基类化合物对酪氨酸酶有抑制作用[1]，由于糖苷类物质是多羟基化合物，说明这类物质很可能是继酚类、芪类、黄酮等外的新型、低副作用的酪氨酸酶抑制剂结构类型。

红藻糖苷来源于海洋红藻，含量非常高，在藻体中达到1.5%～8%，资源丰富[14]。有报道指出，红藻糖苷还具有保水、保湿和抗氧化等多种功效[8-9]，法国LVMH集团旗下娇韵诗护肤品中的水润活肌保湿精华、纪梵希全新水漾活妍眼霜以及Thetsaio的珊瑚草柔敏抗氧化甘露等产品中都含有红藻糖苷。而酪氨酸酶抑制效果的发现，将能为其在化妆品中的应用增加新的功效。

本研究显示，红藻糖苷对B16-F0 黑素瘤细胞毒性不强，却能有效抑制该细胞合成黑色素。从酶活抑制的效果来看，红藻糖苷对酪氨酸酶的单酚和二酚酶活性都有作用，但并没有明显延长单酚酶的迟滞时间，这与熊果苷、甲基水杨醛等物质的抑制效果不同。但红藻糖苷对酪氨酸双酚酶的抑制效果却强于单酚酶，并且表现出竞争性抑制作用，说明红藻糖苷能够作为底物类似物与酶活性中心竞争结合，抑制酶活性，从而达到减少黑色素合成的目的。

综上所述，红藻糖苷能够通过抑制酪氨酸酶活，特别是通过竞争性抑制酪氨酸二酚酶活性，达到抑制细胞黑色素合成的作用。

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Suppression of melanin formation by floridoside

JIAN Qiu-li1, JIANG Li-gang2, YAN Jiang-yan1, CHEN Hai-min1

(1. Key Laboratory of Marine Bioengineering of Zhejiang, Ningbo University, Ningbo 315211; 2. PROYA Companies, Hangzhou 310012, China)

R285

A

2095-1736(2017)05-0039-04

2016-09-26；

2016-11-14

国家海洋公益性行业科研专项(201505033)；宁波市科技计划项目(2017C110026)

翦秋丽，硕士研究生，主要研究方向为海洋生物，E-mail:1462746181@qq.com

陈海敏，研究员，主要研究方向为海洋生物，E-mail: chenhaimin@nbu.edu.cn

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.05.039