柚皮素对结直肠癌细胞侵袭能力及细胞中MMP-2、MMP-9表达的影响

黄 敏 吴传中 郝传铮 沈 芳 朱立成

(南通大学附属医院中医科，江苏 南通 226001)

柚皮素对结直肠癌细胞侵袭能力及细胞中MMP-2、MMP-9表达的影响

黄 敏 吴传中1郝传铮 沈 芳 朱立成2

(南通大学附属医院中医科，江苏 南通 226001)

目的探讨柚皮素对结直肠癌细胞侵袭能力及细胞中基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9表达的影响。方法以人结直肠癌细胞SW620为研究对象，分别用0、10、20、40、60、80、120 μg/ml的柚皮素作用于SW620细胞，培养48 h后，四甲基偶氮唑盐(MTT)检测细胞增殖能力并计算半数抑制浓度。0、50 μg/ml的柚皮素作用于SW620细胞48 h后，Transwell小室检测细胞侵袭能力，Western印迹检测细胞中MMP-2、MMP-9、发状分裂相关增强子1(Hes1)、Notch神经同源蛋白1前体(Notch1)表达水平。结果10、20、40、60、80、120 μg/ml的柚皮素作用后的细胞存活率均明显低于0 μg/ml柚皮素作用组(P<0.01)。计算半数抑制浓度为 (51.76±1.48)μg/ml。50 μg/ml柚皮素作用后的侵袭细胞数目及细胞中MMP-2、MMP-9、Hes1、Notch1水平均明显低于0 μg/ml柚皮素作用组(P<0.01)。结论柚皮素能够抑制结直肠癌细胞增殖、侵袭能力，作用机制可能与Notch1信号通路有关。

结直肠癌；柚皮素；侵袭；增殖

结直肠癌是一种发生于消化系统的恶性肿瘤，具有发病隐匿、发展速度快、恶性程度高等特点，其中男性的发病率高于女性〔1〕。常见的治疗结直肠癌的方法为手术治疗、放疗及化疗，但远远不能满足需求。柚皮素是一种提取自柑橘类水果中的化合物，具有抗肿瘤作用〔2〕。有研究表明，柚皮素对胃癌、肝癌、鼻咽癌等癌症均具有抑制作用〔3〕。用不同浓度的柚皮素作用于鼻咽癌和胃癌细胞，细胞的增殖能力均显著下降〔4〕。本文旨在明确柚皮素对结直肠癌细胞增殖侵袭能力的作用。

1 材料与方法

1.1材料 细胞：人结直肠癌细胞SW620购于上海生博生物医药科技有限公司。主要仪器及试剂：基质金属蛋白酶(MMP)-2单克隆抗体、MMP-9单克隆抗体、发状分裂相关增强子1(Hes1)单克隆抗体、Notch神经同源蛋白1前体(Notch1)单克隆抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)单克隆抗体均购于美国CTS；胎牛血清、RPMI1640培养基均购自美国Gibco；胰蛋白酶、噻唑蓝(MTT)购于美国Sigma；柚皮素购自上海紫铭试剂厂；二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒、蛋白提取试剂盒均购自碧云天生物试剂研究所；HBS-1096C Pro 酶标分析仪购自南京德铁实验设备有限公司。

1.2细胞培养 取出保存在液氮罐中的SW620细胞，迅速放到37℃的水浴锅中，观察细胞完全融化后，加入含有10%胎牛血清的RPMI1640细胞培养液悬浮细胞，在室温下1 000 r/min离心10 min，弃上清液，加入细胞培养液重悬细胞，接种到细胞培养瓶中，在37℃，5% CO2培养箱中培养48 h，观察细胞密度约为80%时，倒掉细胞培养液，加入0.25%胰蛋白酶消化细胞，1 000 r/min离心10 min，弃上清液，用细胞培养液悬浮细胞，按照1∶2比例接种于细胞瓶中培养。

1.3MTT检测细胞增殖 取培养至对数生长期的结直肠癌细胞，消化后，以2×104个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中培养24 h，在细胞中加入不同浓度的柚皮素，使其终浓度为0、10、20、40、60、80、120 μg/ml，同时设置空白组，空白组中不加入细胞，每组设置6个复孔。放在37℃，5% CO2培养箱中培养48 h，加入 MTT溶液20 μl(5 mg/ml)，在37℃孵育4 h，弃上清液，每孔中加150 μl的二甲基亚砜(DMSO)溶液，在室温下摇床上缓慢震荡6 min，观察结晶物溶解后，放置于酶标仪中，在波长为490 nm处测定并记录各组的吸光度OD，以0 μg/ml柚皮素作用组为对照，计算细胞存活率。细胞存活率=(柚皮素作用组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)。

1.4Transwell小室检测细胞侵袭 在24孔Transwell小室中加入基质胶，每孔加入30 μl，放置于37℃孵育1 h。侵袭实验前分别用0、50 μg/ml柚皮素作用于结直肠癌细胞48 h，胰蛋白酶消化后，用不含胎牛血清的细胞培养液悬浮细胞，将细胞接种到Transwell小室的上室，在小室的下室加入含10%胎牛血清的RPMI1640细胞培养液30 μl，放在37℃，5% CO2培养箱中培养16 h。棉签擦掉上室的细胞和基质胶，用甲醇固定膜1 h后，加入龙胆紫染色1 h，显微镜下观察细胞侵袭细胞数量。

1.5Western印迹检测细胞中MMP-2、MMP-9、Hes1、Notch1表达水平 用0、50 μg/ml的柚皮素作用于结直肠癌细胞48 h，按照细胞蛋白提取试剂盒说明书提取细胞总蛋白，BCA蛋白浓度测定试剂盒检测提取的蛋白浓度。将蛋白样品与5×上样缓冲液按照4∶1的比例混合后，放在100℃煮沸5 min。每组吸取30 μl加入到聚丙烯酰胺凝胶上样孔中，80 V电压电泳30 min后，调整电压为120 V至电泳结束。取出蛋白凝胶，在电压100 V，4℃转膜2 h至硝酸纤维素膜上。5%脱脂奶粉在37℃封闭2 h，Tris盐酸缓冲液(TBST)洗涤3次，每次5 min，加入一抗(600倍稀释，4℃孵育过夜)、二抗(1 000倍稀释，37℃孵育2 h)反应后，滴加显色液，以GAPDH为内参，分析目的蛋白表达水平。

1.6统计学方法 应用SPSS22.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1细胞增殖检测结果 10、20、40、60、80、120 μg/ml的柚皮素作用后的细胞存活率均明显低于0 μg/ml(P<0.01)。见图1。计算半数抑制浓度为(51.76±1.48)μg/ml。后期选用50 μg/ml的柚皮素作用于结直肠癌细胞。

2.2细胞侵袭能力检测结果 50 μg/ml的柚皮素作用后的结直肠癌细胞侵袭数目及MMP-9、MMP-2水平均明显低于0 μg/ml的柚皮素作用组(P<0.01)。见图2。

2.3细胞中Hes1、Notch1表达水平检测结果 50 μg/ml的柚皮素作用后的细胞中Hes1、Notch1表达水平均明显低于0 μg/ml的柚皮素作用组(P<0.01)。见图3。

图1 柚皮素对细胞增殖的影响

A：侵袭细胞数；B：Western印迹结果图；C:蛋白相对表达量；与0 μg/ml组比较：1)P<0.01,下图同图2 柚皮素对细胞侵袭能力的影响

A：Western印迹结果图；B：蛋白相对表达量图3 柚皮素对细胞中Hes1、Notch1表达影响结果

3 讨 论

结直肠癌的发病率在全部恶性肿瘤中位居第3位，死亡率位居第5位〔5〕。职业、饮食习惯、遗传等多种因素均可导致结直肠癌的发生。目前治疗结直肠的方法主要为手术治疗，但由于结直肠癌具有易转移、易复发等特点，寻找新的治疗结直肠的方法是目前研究的重点。柚皮素具有抗菌、消炎、抗氧化、抗癌、降血脂、利胆等多种生物学作用〔6〕。柚皮素是一种提取自柑橘类水果中的二氢黄酮类化合物，具有价廉、取材方便、安全等特点〔7〕。柚皮素的抗肿瘤作用已经在多种癌症中得以证实。研究表明，柚皮素能够呈剂量依赖型的抑制胃癌细胞增殖〔8〕。癌细胞侵袭是一个极为复杂的过程，受到一系列细胞因子的共同作用。MMPs是目前研究最多的与细胞侵袭有关的蛋白家族。MMP-2、MMP-9是MMP家族的成员。有研究表明，MMP-2、MMP-9在宫颈癌、胃癌、食管癌、胶质瘤等组织中异常激活〔9〕。柚皮素能够通过降低MMP-2、MMP-9的表达水平影响胃癌细胞的侵袭能力〔8〕。本研究结果提示，柚皮素能够通过作用于MMP-2、MMP-9影响结直肠癌细胞的侵袭能力。

Notch1信号转导通路参与生命机体的胚胎发育、器官形成等过程，在癌症、糖尿病肾病、动脉粥样硬化等疾病形成过程中也有重要作用〔10〕。有研究表明，抑制Notch1信号通路能够抑制人脑胶质瘤细胞的增殖，反之，激活Notch1信号通路能够促进增殖〔11〕。本研究提示，柚皮素可能作用于Notch1信号通路影响结直肠癌细胞增殖侵袭能力。

1van Cutsem E,Lenz HJ,Köhne CH,etal.Fluorouracil,leucovorin,and irinotecan plus cetuximab treatment and RAS mutations in colorectal cancer〔J〕.J Clin Oncol,2015;33(7):692-700.

2Assini JM,Mulvihill EE,Burke AC,etal.Naringenin prevents obesity,hepatic steatosis,and glucose intolerance in male mice independent of fibroblast growth factor 21〔J〕.Endocrinology,2015;156(6):2087-102.

3Kocyigit A,Koyuncu I,Taskin A,etal.Antigenotoxic and antioxidant potentials of newly derivatized compound naringenin-oxime relative to naringenin on human mononuclear cells〔J〕.Drug Chem Toxicol,2016;39(1):66-73.

4Koh RY,Sim YC,Toh HJ,etal.Cytotoxic and apoptogenic effects of Strobilanthes crispa Blume extracts on nasopharyngeal cancer cells〔J〕.Mol Med Rep,2015;12(4):6293-9.

5王 燕,赵月霞.PKC-a,K-Ras 蛋白在结直肠癌中的表达及意义〔J〕.中国老年学杂志,2015;35(6):1499-500.

6季 鹏,赵文明,于 桐.柚皮素的最新研究进展〔J〕.中国新药杂志,2015;24(12):1382-6.

7Al-Rejaie SS,Aleisa AM,Abuohashish HM,etal.Naringenin neutralises oxidative stress and nerve growth factor discrepancy in experimental diabetic neuropathy〔J〕.Neurol Res,2015;37(10):924-33.

8Zhang H,Zhong X,Zhang X,etal.Enhanced anticancer effect of ABT-737 in combination with naringenin on gastric cancer cells〔J〕.Exp Ther Med,2016;11(2):669-73.

9Desmeules P,Trudel D,Turcotte S,etal.Prognostic significance of TIMP-2,MMP-2,and MMP-9 on high-grade serous ovarian carcinoma using digital image analysis〔J〕.Hum Pathol,2015;46(5):739-45.

10Baumgart A,Mazur PK,Anton M,etal.Opposing role of Notch1 and Notch2 in a KrasG12D-driven murine non-small cell lung cancer model〔J〕.Oncogene,2015;34(5):578-88.

11Alniaimi AN,Demorest-Hayes K,Alexander VM,etal.Increased Notch1 expression is associated with poor overall survival in patients with ovarian cancer〔J〕.Int J Gynecol Cancer,2015;25(2):208-13.

〔2017-03-05修回〕

(编辑 袁左鸣)

R735.3

A

1005-9202(2017)19-4750-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.025

南通市科技局科研基金资助项目(No.MS22015119)

1 南通市第三人民医院老年科 2 南通市第三人民医院呼吸科

黄 敏(1983-)，女，硕士，主治医师，主要从事肿瘤内科研究。