FABP3基因对心肌细胞凋亡的影响

杨 洋 徐 娅 刘杨安 鲍 媛 杜鸿丽 杨 名

(华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院网络医疗部，湖北 武汉 430014)

FABP3基因对心肌细胞凋亡的影响

杨 洋 徐 娅 刘杨安 鲍 媛 杜鸿丽 杨 名

(华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院网络医疗部，湖北 武汉 430014)

目的脂肪酸结合蛋白(FABP)3基因对心肌细胞凋亡的影响及机制。方法将H9C2心肌细胞分为空白对照组、阴性对照组、FABP3沉默组、FABP3沉默+空质粒组及FABP3沉默+过表达人FABP3组，转染72 h后Western印迹检测各组细胞中FABP3的蛋白表达；流式细胞仪检测细胞凋亡；Western印迹检测Cleaved caspase3、Bcl-2蛋白表达。结果空白对照组与阴性对照组及FABP3沉默组和FABP3沉默+空质粒组之间FABP3蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)，FABP3沉默组和FABP3沉默+空质粒组FABP3的蛋白表达显著低于空白对照组与阴性对照组，FABP3沉默+过表达人FABP3组FABP3的蛋白表达显著高于FABP3沉默组和FABP3沉默+空质粒组(P<0.01)；FABP3沉默组和FABP3沉默+空质粒组细胞凋亡率及Cleaved caspase3蛋白表达显著高于空白对照组与阴性对照组，Bcl-2蛋白表达显著低于空白对照组与阴性对照组FABP3(P<0.01)；沉默+过表达人FABP3组细胞凋亡率及Cleaved caspase3蛋白表达显著低于FABP3沉默组和FABP3沉默+空质粒组，Bcl-2蛋白表达显著高于FABP3沉默组和FABP3沉默+空质粒组(P<0.01)。结论沉默FABP3的表达可促进H9C2心肌细胞凋亡，过表达则抑制细胞凋亡，其机制与调节Cleaved caspase3及Bcl-2蛋白表达有关。

FABP3；心肌细胞；凋亡

心肌细胞凋亡可参与心力衰竭、冠心病、心肌炎、心绞痛及心脏自身免疫性疾病等多种心血管疾病的发生过程，但引起心肌细胞凋亡的机制研究的尚不清楚〔1〕。脂肪酸结合蛋白(FABP)3又称为心脏型脂肪酸结合蛋白，为一种非分泌的可溶性蛋白，其可参与线粒体能量代谢，在心肌细胞能量产生过程中可将胞内长链脂肪酸转运至线粒体，其过表达可显著抑制心肌细胞增殖，诱导细胞凋亡〔2,3〕。文献报道，FABP3可作为检测早期心肌损伤的生物标志物〔4〕。但FABP3对心肌细胞凋亡的影响机制研究的尚不清楚。本研究通过沉默和过表达FABP3，检测其对心肌细胞凋亡的影响及机制。

1 材料与方法

1.1试剂与仪器 H9C2细胞株购自于中国科学院细胞库；FABP3 siRNA及阴性慢病毒购自上海吉凯基因化学技术有限公司；目的质粒pCXN2-Flag-hFABP3及空质粒pCXN2--Flag由武汉大学动物实验中心提供；FABP3、Cleaved caspase3、Bcl-2单克隆抗体及辣根过氧化物标记的二抗均购自美国abcam公司；CO2细胞培养箱购自德国Heraeus公司；BCA试剂盒、Annexin V-FITC凋亡试剂盒均购自碧云天生物技术研究所；流式细胞仪购自美国Becton Dickinson公司；PAGE凝胶电泳仪、电泳凝胶图像分析系统均购自美国Bio-Rad公司。

1.2H9C2心肌细胞培养、慢病毒及质粒转染 H9C2心肌细胞在含有10%胎牛血清的培养基，置于37℃，5% CO2，95%饱和湿度的培养箱中培养。以1×105个/孔接种于6孔细胞培养板中，细胞生长密度达到60%以上时更换新的培养基。将细胞随机分为空白对照组、阴性对照组及FABP3沉默组，各组细胞培养24 h后换为新鲜的培养基，在阴性对照组及FABP3沉默组中加入工作浓度为1.5 μg/ml的嘌呤霉素，空白对照组不加嘌呤霉素，筛选被慢病毒感染的细胞，各组细胞再继续培养48 h后用荧光显微镜观察细胞的感染效率。重新消化各组细胞，使每组的浓度为5×105个，接种于培养皿中，次日随机选择2皿FABP3组沉默的细胞，分别转染空质粒和过表达人的FABP3质粒，培养6 h后更换培养液，此时细胞被分为空白对照组、阴性对照组、FABP3沉默组、FABP3沉默+空质粒组及FABP3沉默+过表达人FABP3质检组，各组细胞再继续培养72 h，收集细胞，用于后续实验。

1.3各组细胞中FABP3的蛋白表达检测 取收集的各组细胞，根据细胞蛋白提取试剂盒提取各组中的总蛋白，采用二喹啉甲酸(BCA)法对总蛋白进行定量，取50 μg蛋白样品，按照1∶1的比例与上样缓冲液混匀，置于100℃的孵育器中变性5 min，后续依次进行点样、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、PVDF转膜、脱脂奶粉封闭、一抗孵育(FABP3、GAPDH，1∶1 000稀释)、洗膜、二抗孵育(辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，1∶1 000稀释)、TBST洗膜，ECL发光剂显影，自动凝胶成像系统采集图像。以GAPDH作为内参，分析FABP3的蛋白表达水平。

1.4细胞凋亡检测 采用Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡。以1×105个/孔将各组细胞接种于6孔细胞培养板中，转染72 h后收集细胞，PBS洗涤细胞3次，500 μl结合缓冲液悬浮细胞，取悬浮细胞再加入5 μl的Annexin-V和PI，充分混匀后置于室温环境下避光反应15 min，再加入400 μl结合缓冲液，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.5Cleaved caspase3、Bcl-2蛋白表达检测 以5×105个/孔将各组细胞接种于10 cm的细胞培养皿中，72 h后收集细胞，按照1.3方法提取细胞蛋白并检测蛋白含量，以GAPDH作为内参，分析Cleaved caspase3、Bcl-2的蛋白表达水平。

1.6统计学方法 采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1FABP3在转染后细胞中的表达 空白对照组与阴性对照组及FABP3沉默组和FABP3沉默+空质粒组FABP3蛋白表达差异不具有统计学意义(P>0.05)，FABP3沉默组和FABP3沉默+空质粒组显著低于空白对照组与阴性对照组，FABP3沉默+过表达人FABP3组显著高于FABP3沉默组和FABP3沉默+空质粒组(P<0.01)。见图1。

2.2FABP3对细胞凋亡率的影响 FABP3沉默组和FABP3沉默+空质粒组细胞凋亡率显著高于空白对照组与阴性对照组，FABP3沉默+过表达人FABP3组细胞凋亡率显著低于FABP3沉默组和FABP3沉默+空质粒组(P<0.01)。见图2。

1：空白对照组；2：阴性对照组；3： FABP3沉默组；4：FABP3沉默+空质粒组；5：FABP3沉默+过表达人FABP3组；与空白对照组比较：1)P<0.01；与FABP3沉默+过表达人FABP3组比较：2)P<0.01；下图同图1 FABP3在转染后细胞中的表达

图2 FABP3对细胞凋亡率的影响

2.3FABP3对Cleaved caspase3、Bcl-2蛋白表达的影响 FABP3沉默组和FABP3沉默+空质粒组Cleaved caspase3蛋白表达显著高于空白对照组与阴性对照组，FABP3沉默+过表达人FABP3组Cleaved caspase3蛋白表达显著高于FABP3沉默组和FABP3沉默+空质粒组(P<0.01)；FABP3沉默组和FABP3沉默+空质粒组Bcl-2蛋白表达显著低于空白对照组与阴性对照组，FABP3沉默+过表达人FABP3组Bcl-2蛋白表达显著高于FABP3沉默组和FABP3沉默+空质粒组(P<0.01)。见图3。

图3 FABP3对Cleaved caspase3、Bcl-2蛋白表达的影响

3 讨 论

心血管疾病是危害人类健康、影响中老年人生活质量的主要疾病，其主要机制是心肌缺血缺氧导致心肌细胞凋亡，最后引起心力衰竭。心肌细胞凋亡是机体在一系列的程序控制作用下的一种病理过程，研究引起心肌细胞凋亡的基因及影响其凋亡的信号通路对于阻断凋亡发生、维持或改善心功能、防止心肌细胞数目减少具有重要意义〔5〕。FABP3位于人染色体1p33-p32，编码133个氨基酸，主要在细胞质中表达，参与转运代谢及脂肪酸吸收，同时通过一系列过程为心肌提供能量〔6〕。研究显示，过表达FABP3后能使心肌细胞的分化受到抑制，沉默FABP3的表达可促进细胞的凋亡，胞内ATP生成减少，心肌细胞的线粒体形态异常〔7〕。本研究也通过表达FABP3和沉默FABP3的方法，研究对心肌细胞凋亡的影响，结果与前人的研究一致。

细胞凋亡是机体在基因控制下的一种程序性死亡过程，其过程需要一系列酶的参与，目前caspase家族及Bcl-2家族是研究最多的两大家族〔8〕。Caspase3是caspase家族的关键蛋白，是细胞凋亡过程主要的终末剪切酶，一般情况下Caspase3在胞质中以无活性的酶原形式存在，受到凋亡信号刺激后被激活，从而引起细胞凋亡〔9,10〕。有研究显示，Caspase3的激活可引起细胞的凋亡〔11〕。Bcl-2是Bcl-2家族重要的一员，定位于18q21.3染色体，是Bcl-2家族的抑制凋亡基因，许多细胞凋亡过程中均可引起Bcl-2表达的下调，而Bcl-2的过表达可通过抑制多种因素降低细胞的凋亡〔12〕。有研究显示心肌细胞凋亡过程中Bcl-2的表达下调〔13〕。本研究结果提示，沉默FABP3的表达可促进H9C2心肌细胞凋亡，过表达则抑制细胞凋亡，其机制与调节Cleaved caspase3及Bcl-2蛋白表达有关。该研究为心血管疾病的诊断及治疗提供了理论基础。

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2Dubey PK,Goyal S,Mishra SK,etal.Identification of polymorphism in fatty acid binding protein 3 (FABP3) gene and its association with milk fat traits in riverine buffalo (Bubalus bubalis)〔J〕.Trop Animal Health Prod,2016;48(4):849-53.

3Hasanally D,Edel A,Chaudhary R,etal.Psoriasis is associated with metabolic syndrome and cardiovascular disease.Fatty acid-binding proteins (FABP) have been recognized as predictors of these systemic disorders.The aim of this study was to assess correlations between levels of serum heart and adipocyte fatty acid-binding proteins (FABP3,FABP4) and disease severity,indicators of inflammation or metabolic disturbances,and topical treatment〔J〕.Lipids,2017;52(1):51-60.

4Yao DW,Luo J,He QY,etal.Thyroid hormone responsive (THRSP) promotes the synthesis of medium-chain fatty acids in goat mammary epithelial cells〔J〕.J Dairy Sci,2016;99(4):3124-33.

5Corbalan JJ,Vatner DE,Vatner SF.Myocardial apoptosis in heart disease:does the emperor have clothes〔J〕?Basic Res Cardiol,2016;111(3):1-13.

6Tang Z,Shen Q,Xie H,etal.Elevated expression of FABP3 and FABP4 cooperatively correlates with poor prognosis in non-small cell lung cancer(NSCLC)〔J〕.Oncotarget,2016;7(29):46253.

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12Delbridge ARD,Grabow S,Strasser A,etal.Thirty years of BCL-2:translating cell death discoveries into novel cancer therapies〔J〕.Nature Rev Cancer,2016;16(2):99-109.

13Zhang N,Ye F,Zhu W,etal.Cardiac ankyrin repeat protein attenuates cardiomyocyte apoptosis by upregulation of Bcl-2 expression〔J〕.Mol Cell Res,2016;1863(12):3040-9.

〔2017-06-07修回〕

(编辑 郭 菁)

R541.1

A

1005-9202(2017)19-4734-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.019

武汉市临床医学科研项目(WZ15D17)

杨 名(1971-)，男，硕士，主治医师， 主要从事肿瘤内科研究。

杨 洋(1982-)，男，硕士，主治医师， 主要从事肿瘤内科研究。