大鼠皮肤的保存与撕脱伤模型冷藏皮延迟植皮的实验研究

李 季 苗智莹 蔡锦芳 邹 林 李宗玉 崔宜栋

(郑州市第一人民医院骨外科，河南 郑州 450004)

大鼠皮肤的保存与撕脱伤模型冷藏皮延迟植皮的实验研究

李 季1苗智莹2蔡锦芳1邹 林1李宗玉1崔宜栋3

(郑州市第一人民医院骨外科，河南 郑州 450004)

目的对比研究冷藏皮和反植皮的成活率及冷藏皮和液氮冷冻皮肤的病理学变化。方法分析冷藏皮延迟植皮的成活率及病理学变化情况，并对冷藏皮和液氮冷冻皮进行病理形态学和细胞凋亡率观察。结果动物实验研究表明，即时回植组与冷藏皮24 h、48 h组成活率无统计学差异(P>0.05)；冷藏皮72 h、120 h、168 h回植组成活率明显低于即时回植组(P<0.05)，提示冷藏皮回植黄金时间为48 h以内。大鼠皮肤细胞空泡变性率比较，冷藏皮在第1,3,5,10天的空泡变性率均高于即时回植组(P<0.05)，但第1天的空泡变性率接近即时回植组，而第3,5,10天的空泡变性率与即时回植组差距较大。液氮组第1,3,5,10天的空泡变性率也高于即时回植组(P<0.05)，但是空泡变性率均较接近即时回植组，组间绝对数差距也较冷藏组的组间差距小。大鼠皮肤细胞凋亡率比较，冷藏皮在第1,3,5,10天的凋亡率均高于即时回植组(P<0.05)，但第1、3天的凋亡率无统计学差异(P>0.05)，而与第5、10天的凋亡率差距较大。液氮组的第1,3,5,10天的凋亡率明显高于即时回植组(P<0.05)，凋亡率也明显高于冷藏组。结论皮肤冷藏48 h以内为回植的安全期限，液氮冷藏皮肤，细胞变性率低，但是冻存和解冻过程可能导致细胞凋亡率增加。

皮肤撕脱伤；冷藏皮；液氮冻存皮肤

撕脱伤手术大多采用即时削薄回植或彻底去除脂肪组织，即时反植皮覆盖创面，面积小者手术时间不长，对机体影响不大；但是当大面积撕脱伤时，对皮肤处理时间长，伤者创面暴露长，出血多，由创面蒸发丢失的液体量也增加，导致患者血流动力学不稳定，甚至大面积出血凝血，导致血小板短时间大量消耗，出现弥散性血管内凝血(DIC)〔1,2〕。另外，创面大面积长时间暴露，伤者的感染率高，因此，传统对大面积撕脱伤的处理不符合损伤控制治疗原则〔3〕。相关研究显示，冷藏皮回植可减少创面暴露时间，减少医源性创伤，有充分时间处理皮肤，利于后期修复〔4〕。对皮肤保存办法的进一步实验研究发现〔5〕，液氮冷冻能有效降低细胞的空泡变性率，但是冻存复苏的皮肤细胞凋亡率较冷藏皮肤明显增高，可能是由于皮肤冷冻与解冻的过程中，温度的急剧变化诱发凋亡程序开启，进而导致上述变化。本研究对比冷藏皮和反植皮的成活率，并同时分析冷藏皮和液氮冷冻皮肤的病理学变化。

1 材料与方法

1.1主要试剂 低糖DMEM固体培养基(四季青公司，中国)，胎牛血清，免疫组化凋亡试剂盒(sigma，美国)

1.2动物 Wistar大鼠102只，体重200～215 g，购自北京华阜康生物科技有限公司，动物证书合格编号：SCXK(京)2009-0004，由天津中医药大学动物实验中心无菌培养室内饲养。所有大鼠按照天津中医药大学动物伦理委员(TCM-LAEC2015026)的指导原则处理。

1.3方法

1.3.1大鼠皮肤撕脱伤模型 大鼠褪毛，在无菌条件下，将大鼠臀部切取大约2 cm×2 cm带全脂肪层皮肤，形成撕脱伤模型。然后将臀部切取皮肤去除脂肪层，放入无菌注射器中4℃冷藏备用。等待植皮的大鼠创面，油纱覆盖包扎备用。植皮后打包加压包扎，1 w后打开加压包扎判断成活情况。

1.3.2大鼠皮肤液氮冻存 大鼠皮肤撕脱伤模型建立后，将去除脂肪层的大鼠皮肤分装到放有血清和二甲基亚砜的无菌冻存管内，将冻存管密封，贴上标签，放入已做好标记的袋中；将冻存管放到程序降温盒-80℃冻存，24 h后转入液氮中长期保存。

1.3.3大鼠液氮冻存皮肤复苏 从液氮中取出大鼠皮肤冻存管，迅速在37℃温水中轻轻摇动令其尽快融化，尽量短的时间融化后，取出置于冰上。10 ml DMEM培养基稀释，1 000 r/min 离心10 min，弃上清，再加入适量DMEM培养基中，置于37℃、7.5% CO2孵箱中培养1 h。从37℃孵箱中取出冻存管，无菌条件下打开冻存管，转入离心管，加入10倍以上培养液，1 000 r/min离心5 min，弃上清保存备用。分为撕脱皮即时回植组(脱皮后立即植皮)，冷藏皮24、48、72、120 h回植组，冷藏皮168 h回植组，分别在对应的时间进行回植手术。

1.3.4dUTP缺口末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡 将皮肤蜡块样本用二甲苯浸洗切片2次，每次5 min，梯度乙醇水化，0.85% NaCl浸洗5 min，磷酸盐缓冲液(PBS)浸洗，浸入4%多聚甲醛固定15 min，PBS浸洗，每片加入100 μl 20 μg/ml Proteinase K室温处理15 min。PBS浸洗，浸入4%多聚甲醛固定5 min；PBS浸洗，加100 μl平衡液，湿盒平衡10 min。制备TUNEL反应混合液：冷藏组和液氮冻存组用1 μl rTdT加1 μl 生物素标记的dUTP加98 μl平衡液混匀；即时回植组先加入100 μl DNase1 缓冲液孵育5 min，甩掉液体后再加100 μl 10 U/ml DNase1酶切10 min，用去离子水冲洗4次，PBS浸洗5 min，加100 μl TUNEL反应混合液于标本上，加盖玻片在37℃暗湿盒中反应1 h。浸入2×SSC 15 min终止反应，PBS浸洗，浸入0.3% H2O215 min，PBS浸洗，加100 μl链霉亲和素标记辣根过氧化物酶(HRP)30 min，PBS浸洗，加100 μl二氨基联苯胺(DAB)混合液10 min，镜下出现浅棕色背景时，去离子水冲洗。经过苏木素复染后，3 s后立即用自来水冲洗。梯度酒精脱水、二甲苯透明1 min、中性树胶封片，显微镜下观察。阳性细胞着色定位于细胞核，呈棕黄色，背景呈紫蓝色。皮肤表皮细胞阳性或颗粒细胞中超过50%细胞阳性，判断该细胞凋亡。计算各组凋亡率：凋亡率=凋亡细胞数/整张切片中计数总数×100%。大鼠皮肤苏木素-伊红(HE)切片：分别选择0、1、3、5、10 d的大鼠皮肤，光学显微镜下观察皮肤表皮细胞的空泡细胞，每张切片计数200个细胞，计算空泡变性细胞率，每组做三张切片计数。计算各组表皮细胞空泡变性率：空泡变性率=空泡变性细胞数/整张切片中计数总数×100%。

1.3.5大鼠冷藏皮电镜观察 取大鼠冷藏皮24 h和168 h两个样本，按程序送济南军区总医院电子显微镜室做电镜切片并照片。观察切片的细胞器及细胞核染色质，是否有细胞器水肿、颗粒变性及核染色质浓聚反应。

1.4统计学方法 应用SPSS20.0软件，计数资料行χ2检验，计量资料行t检验。

2 结 果

2.1大鼠皮肤撕脱伤模型冷藏皮回植成活率分析 即时回植组〔85.71%(12/14)〕与冷藏皮24 h〔80.95%(17/21)〕、48 h组〔72.22%(13/18)〕成活率比较接近，冷藏皮72 h、120 h、168 h回植组成活率分别为47.06%(8/17)，31.25%(5/16)，20.00%(3/15)。可见，随着冷藏时间延长，成活率逐渐下降。

2.2多个样本构成比之间两两比较分析 即时回植组与冷藏皮24 h、48 h组成活率之差分别为4.76%、13.49%，无统计学差异(χ2=0.134,0.838；P=0.714，0.359)；冷藏皮72 h、120 h、168 h回植组成活率明显低于即时回植组，构成比之差分别为38.05%、54.46%、65.71%，有统计学差异(χ2=5.011,9.019,12.523；P=0.025,0.003,0.000)；冷藏皮48 h内回植的成活率明显高于48 h以后回植成活率(P<0.05)。

2.3大鼠皮肤4℃冷藏细胞和液氮冻存细胞凋亡率分析 大鼠皮肤4℃冷藏在第1,2天的表皮细胞凋亡率基本无差别，冷藏3 d以上的大鼠皮肤表皮细胞凋亡率明显增加，凋亡率与冷藏时间正相关。大鼠皮肤经过液氮冻存和解冻复苏后，表皮细胞凋亡率显著上升，第3天和第5天的凋亡率无显著差异，第10天凋亡率明显上升，凋亡率与解冻复苏后时间正相关。大鼠皮肤4℃冷藏与液氮冻存细胞凋亡率计数均与时间呈正相关，第1天和第5天的凋亡率相近；第3天、第10天液氮组的细胞凋亡率均明显高于冷藏组。见表1。

表1 大鼠皮肤4℃冷藏细胞和液氮冻存细胞凋亡率比较

与即时回植组比较：1)P<0.05，下表同

图1 大鼠皮肤病理切片空泡变性(HE)与凋亡细胞原位杂交结果(×400)

2.4大鼠皮肤4℃冷藏细胞和液氮冻存细胞空泡变性分析 见图1，表2。大鼠皮肤4℃冷藏细胞空泡变性率虽然显著高于即时回植组，但是第1天的表皮细胞空泡变性率比较接近于即时回植组；而第3天以后，空泡变性率时间依赖性地增高。在第1天的空泡变性率与冷藏组第1天类似。液氮冻存的新鲜组与第1,3,5,10天的空泡变性率与冷藏组相似，也呈现时间正相关。大鼠皮肤4℃冷藏与液氮冻存细胞空泡变性数比较，第0天和第1天的细胞空泡变性计数基本一致。从第3天开始，液氮组的细胞空泡变性计数低于冷藏组。

表2 大鼠皮肤4℃冷藏细胞及液氮冻存细胞空泡变性计数比较

2.5电子显微镜观察分析 电镜观察，大鼠冷藏皮24 h组皮肤细胞器结构完整，无明显水肿，无核染色体聚集等表现；而168 h组可见明显细胞器水肿，细胞核的染色体聚集表现。见图2。

图2 电子显微镜观察回植皮不同冷藏时间的情况(×400)

3 讨 论

本次研究证实，大鼠皮肤冷藏24 h后表皮空泡变性率明显增加，但是在24 h内的空泡变性率与新鲜皮肤的空泡变性率接近，而在72 h后，表皮空泡变性率大大增加。对于皮肤表皮细胞的凋亡率的研究也发现，24 h后的皮肤表皮细胞凋亡率明显增加。液氮保存复苏后的大鼠表皮细胞，空泡变性率虽然也较新鲜组增加，但是大大低于冷藏组各时间段的空泡变性率，而随着冻存时间的推移，凋亡率大幅度增加，远远高于同一时段的冷藏皮。

皮肤细胞脱离机体后，在缺氧缺血情况下，不可避免地发生细胞损伤，表现为细胞变性、凋亡等〔6〕。空泡变性有时与气球样变性难以区分，是细胞水肿的一种形态学变化，表现细胞水肿，有明确的空泡，有时胞质疏松，都属于细胞水肿变性的形态学变化〔7〕。细胞变性是组织细胞能耐受刺激因素时做出的适应反应，超过其耐受程度的因素有缺氧、物理因素、化学因素、生物因素及免疫因素〔8〕。变性是坏死的前奏，但是大部分初期的变性在损害因素去除后有可逆的可能。细胞一旦坏死，开始无形态结构无明显改变；死亡6～10 h后，自溶性改变明显时光镜、肉眼可辨，细胞核出现核浓缩、核碎裂、核溶解等变化〔9〕。通过对大鼠皮肤冷藏和液氮冻存的实验研究，我们在光镜下发现了表皮细胞空泡变性的变化情况，说明在离体缺氧的情况下，表皮细胞虽然经过低温冷藏和液氮冻存，降低了细胞的代谢，减少耗氧，但是随着时间的推移，两种保存方法的皮肤表皮细胞空泡变性率逐渐增加，液氮冻存对于代谢的控制明显优于冷藏，表现为空泡变性率远低于冷藏组。本组研究发现脱离开血运后的皮肤组织，可能已经启动了内质网通路和线粒体通路，开始了凋亡的进程。液氮组在第72 h后随着时间的推移凋亡率迅速上升，大大高于冷藏组的凋亡率。

综上所述，皮肤冷藏48 h以内为回植的安全期限，液氮冷藏皮肤细胞变性率低，但是冻存和解冻过程可能导致细胞凋亡率增加，其临床应用的可能性需进一步研究。笔者推测，随着时间的推移液氮低温的刺激使细胞内质网应激反应增加，启动凋亡程序。因此，皮肤液氮保存中如何减少凋亡、减少寒冷对内质网的应激刺激，是重要的研究方向。

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〔2017-03-17修回〕

(编辑 袁左鸣)

R75

A

1005-9202(2017)19-4709-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.009

国家自然科学基金资助项目(No.30973018)

1 济南军区总医院骨外科

2 济南市妇幼保健院杆石桥社区服务中心

3 山东大学齐鲁医院皮肤科

蔡锦芳(1942-)，男，主任医师，主要从事骨科创伤创面修复方面的研究。

李 季(1969-)，男，博士，主治医师，主要从事骨科创伤及肿瘤创面修复方面的研究。