蝙蝠葛碱对阿尔茨海默病小鼠海马晚期糖基化终产物受体和核转录因子-κBp65的影响

张英博 费洪新 郭 家 兴桂华 潘思文 张晓杰 周忠光

(齐齐哈尔医学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

蝙蝠葛碱对阿尔茨海默病小鼠海马晚期糖基化终产物受体和核转录因子-κBp65的影响

张英博 费洪新 郭 家 兴桂华 潘思文 张晓杰 周忠光1

(齐齐哈尔医学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

目的探讨蝙蝠葛碱(DAU)对阿尔茨海默病(AD)小鼠海马晚期糖基化终产物受体(RAGE)和核转录因子(NF)-κBp65的影响。方法雄性小鼠随机分成对照组、模型组、多奈哌齐组(0.001 g/kg)及DAU高、中、低剂量组(2.4、1.2、0.6 g/kg)。小鼠双侧海马微量注射β-淀粉样蛋白(Aβ)1～42(2 g/L)和腹腔注射D-半乳糖(180 mg/kg)诱导AD小鼠，连续治疗35 d后取材。采用Morris水迷宫(MWM)检测AD小鼠学习记忆能力，酶联免疫吸附(ELISA)检测海马白细胞介素(IL)-1β、IL-6含量，免疫组化(IHC)、实时定量(RT)-PCR和Western印迹检测海马RAGE 和NF-κBp65表达。结果与模型组比较，DAU高、中剂量明显改善AD小鼠学习记忆能力，明显降低海马IL-1β、IL-6、RAGE和NF-κBp65水平(均P<0.05)。结论DAU通过抑制海马RAGE和NF-κBp65表达来改善AD小鼠学习记忆能力，以此在AD治疗中发挥重要作用。

蝙蝠葛碱；阿尔茨海默病；晚期糖基化终产物受体

阿尔茨海默病(AD)是一种中枢神经系统(CNS)退行性疾病之一〔1〕，其特点是β-淀粉样蛋白(Aβ)〔2〕沉积形成老年斑(SP)〔3〕，Aβ促进小胶质细胞(MG)〔4〕和星形胶质细胞(As)〔5〕活化而协同产生白细胞介素(IL)-1β〔6〕、IL-6〔7〕、肿瘤坏死因子(TNF)-α〔8〕等，引起学习记忆能力降低〔9〕、认知障碍和人格障碍等。依据神经血管假说〔10，11〕，Aβ通过晚期糖基化终产物受体(RAGE)〔12〕转运进入脑，同时通过核转录因子(NF)-κBp65〔13〕活化而介导炎症反应致脑IL-1β、IL-6含量增加，促进AD发展。祖国医药北豆根有效成分蝙蝠葛碱(DAU)很容易穿过血脑屏障(BBB)〔14〕、抑制膀胱癌EJ细胞株增殖〔15〕、促进细胞凋亡〔16〕、保护脑神经元〔17〕、抗肝纤维化〔18〕、增加抗骨质疏松疗效〔19〕等。然而国内外未见文献报道DAU对AD小鼠海马RAGE和NF-κBp65影响的相关研究，本实验探讨DAU对AD小鼠海马RAGE和NF-κBp65的影响。

1 材料和方法

1.1材料 动物：野生型雄性C57BL/6J小鼠(北京维通利华实验动物技术公司，质量合格证号为SCXK(京)2012-0001。小鼠由李宝龙副主任常规饲养于黑龙江中医药大学实验动物中心。药品和试剂：DAU(Sigma公司，15013102)；多奈哌齐(重庆植恩药业有限公司，20141201)；NF-κBp65(Santa Cruz Biotechnology，sc-109)；RAGE(Boster，ba-1789)；β-actin(Santa Cruz Biotechnology，sc-47778)；IL-1β、IL-6酶联免疫试剂盒(南京建成生物工程研究所，20140401)，RNeasy@ Mini Kit(QIAGEN公司)；Aβ1～42、D-半乳糖(Sigma公司)；其他试剂为国产分析纯(黑龙江中医药大学周忠光教授、齐齐哈尔医学院张英博副教授提供)。仪器：6100型酶标仪(美国RT公司)；STW-1型脑立体定位仪(成都仪器厂)；-80℃冰箱(日本SANYO公司)；Applied Biosystems step one plus定量PCR仪(美国应用生物系统公司)；ZHDSG型Morris水迷宫(MWM，安徽淮北正华生物仪器设备有限公司)；TGL-16G型台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；HMIAS型高清晰度彩色分析系统(武汉千屏影像技术有限公司)等。

1.2方法

1.2.1AD模型制备〔20～25〕小鼠麻醉后，剪去头顶部毛发，固定小鼠，STW-1型脑立体定位仪(成都仪器厂)定位小鼠海马，使用微量加样器于双侧脑室海马内连续注入10 μg Aβ1～42(2 g/L)，留针15 min，包扎；同时腹腔注射D-半乳糖(180 mg/kg)。对照组C57BL/6J小鼠双侧脑室和腹腔注射等量生理盐水。

1.2.2分组与给药 AD小鼠随机分为模型组、多奈哌齐组及DAU高、中、低剂量组，每组8只。另设同月龄、同背景C57BL/6J小鼠8只为对照组。对照组、模型组给予生理盐水灌胃；多奈哌齐组给予多奈哌齐(0.001 g/kg)灌胃；DAU高、中、低剂量组分别给予DAU(2.4、1.2、0.6 g/kg)灌胃，连续灌胃35 d。

1.2.3MWM检测小鼠学习记忆能力 采用MWM检测潜伏期评价小鼠学习能力、游泳距离评价小鼠记忆能力、平台所在象限游泳时间(目标停留时间)和跨越平台所在位置次数(跨平台次数)综合评价小鼠学习记忆保持能力。MWM水深20 cm，平台低于水平面1 cm，水温(23±2)℃，水池内放奶粉形成白色浑浊溶液，平台放第Ⅳ象限，其中第1、2、3、4天为训练时间且每次训练时间60 s，当60 s未找到平台则将小鼠放平台10 s，实验第5天检测小鼠学习记忆能力。

1.2.4酶联免疫吸附(ELISA)检测海马IL-1β、IL-6含量 MWM实验结束后小鼠断头，取小鼠海马匀浆、静置，TGL-16G型台式离心机(上海安亭科学仪器厂)5 000 r/min离心10 min，取上清液，分装，-80℃冰箱(日本SANYO公司)保存。在6100型酶标仪(美国RT公司)上450 nm波长处测定吸光度(A)，绘制标准曲线，求小鼠海马IL-1β、IL-6含量。

1.2.5免疫组化(IHC)检测海马RAGE、NF-κBp65表达 MWM实验结束后，小鼠心脏灌注，按照IHC试剂盒说明书常规制备脑石蜡切片，经过脱蜡、灭活过氧化物酶、H2O2处理、封闭、滴加一抗和二抗、DAB显色、复染、脱水、透明、封片等。采用HMIAS型高清晰度彩色分析系统(武汉千屏影像技术有限公司)计数海马平均光密度值(MOD)。

1.2.6实时定量(RT)-PCR检测海马RAGE、NF-κBp65 mRNA表达 MWM实验结束后，取材海马，Trizol试剂盒提取海马总RNA，逆转录合成cDNA，PCR扩增。设计β-actin、NF-κBp65、RAGE mRNA引物：β-actin正义：5′-CGTGCGTGACATCAAAGAGAA-3′，反义：5′-AACCGCTCGTTGCCAATAGT-3′；NF-κBp65正义：5′-TGTGCGACAAGGTGCAGAAA-3′，反义：5′-ACAATGGCCACTTGCCGAT-3′；RAGE正义：5′-AAAACGACAACCCAGGCGT-3′，反义：5′-ATTCTCTGGCATCTCCGCTTC-3′，引物由上海生工有限公司合成。反转录条件：37℃，15 min，85℃ 15 s。RT-PCR条件：预变性95℃ 10 s，循环95℃ 5 s，60℃ 34 s，扩增40个循环，使用iQTM5软件分析PCR样本Ct值，计算目的基因相对于内参基因(β-actin)表达量(2-△△Ct法)。

1.2.7Western印迹检测海马RAGE、NF-κBp65表达 MWM实验结束后，冰台上迅速取小鼠海马，裂解、冰浴、匀浆、离心、测定蛋白浓度，其余放入液氮中，-80℃冰箱(日本SANYO公司)保存备用。使用前混匀、100℃变性5 min、分离、转膜、封闭，加入一抗、二抗后采用HMIAS型高清晰度彩色分析系统(武汉千屏影像技术有限公司)分析，以目的蛋白灰度值/β-actin条带灰度值计算海马RAGE、NF-κBp65表达。

1.3统计学分析 使用SPSS19.0统计学应用软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1DAU对AD小鼠学习记忆能力的影响 与对照组比较，模型组小鼠潜伏期明显延长、游泳距离明显增加、目标停留时间明显缩短、跨平台次数明显减少(P<0.05)；与模型组比较，多奈哌齐组和DAU高、中剂量组小鼠潜伏期明显缩短、游泳距离明显减少、目标停留时间明显延长和跨平台次数明显增加(P<0.05)，见表1。

表1 DAU对AD小鼠学习记忆能力及海马IL-1β、IL-6的影响

与对照组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05；下表同

2.2DAU对AD小鼠海马IL-1β、IL-6含量的影响 与对照组比较，模型组小鼠海马IL-1β、IL-6含量明显升高(P<0.05)；与模型组比较，多奈哌齐组和DAU高、中剂量组均明显降低(P<0.05)，见表1。

2.3DAU对AD小鼠海马RAGE、NF-κBp65表达的影响 与对照组比较，模型组小鼠海马RAGE、NF-κBp65 MOD值明显升高(P<0.05)；与模型组比较，多奈哌齐组和DAU高、中剂量组均明显降低(P<0.05)，见表2。

2.4DAU对AD小鼠海马RAGE、NF-κBp65 mRNA表达的影响 与对照组比较，模型组小鼠海马RAGE、NF-κBp65 mRNA表达量明显升高(P<0.05)；与模型组比较，多奈哌齐组和DAU高、中剂量组均明显降低(P<0.05)，见表2。

2.5DAU对AD小鼠海马RAGE、NF-κBp65表达的影响 与对照组比较，模型组小鼠海马RAGE、NF-κBp65表达量明显升高(P<0.05)；与模型组比较，多奈哌齐组及DAU高、中剂量组均明显降低(P<0.05)，见表2，见图1。

表2 DAU对AD小鼠海马RAGE、NF-κBp65 mRNA及蛋白表达的影响

1.对照组；2.模型组；3.多奈哌齐组；4.DAU高剂量组；5.DAU中剂量组；6.DAU低剂量组图1 DAU对AD小鼠海马RAGE、NF-κBp65表达的影响

3 讨 论

AD的发病机制还不清楚，AD可出现Aβ在细胞外大量沉积形成SP及海马RAGE、NF-κBp65表达异常等。目前国内外多采用Aβ诱导模型〔20～23〕、D-半乳糖诱导模型〔24，25〕或转基因AD小鼠模型〔26～28〕等。本实验结果显示AD模型建立成功且DAU高、中剂量可改善AD小鼠学习记忆能力，可降低AD小鼠海马炎症介质含量而减弱炎症反应。

说明模型组中Aβ清除能力减弱，导致Aβ积聚，引发AD疾病；而DAU高、中剂量可通过增加RAGE和NF-κBp65表达量来实现其对AD的治疗。另外本实验说明模型组与Aβ转运密切相关RAGE、NF-κBp65 mRNA和蛋白表达量增加，引起Aβ积聚，降低学习记忆能力及增加炎症介质水平而加重炎症反应，引发AD疾病；而DAU高、中剂量组海马RAGE、NF-κBp65 mRNA和蛋白表达量降低，预示DAU高、中剂量可减少Aβ积聚，增强学习记忆能力及降低炎症介质水平而减弱炎症反应，从而延缓AD病程，说明DAU高、中剂量对AD治疗有效。由此显示DAU高、中剂量可改善AD小鼠学习记忆能力和炎症介质水平，这与降低RAGE、NF-κBp65有一定关系。

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〔2017-01-15修回〕

(编辑 李相军)

Theeffectsofdauricineonreceptorforadvancedglycationendproductsandnucleartranscriptionfactor-κBp65ofthehippocampusinAlzheimer'sdiseasemice

ZHANGYing-Bo，FEIHong-Xin，GUOJia，etal.

QiqiharMedicalUniversity，Qiqihaer161006，Heilongjiang，China

ObjectiveTo explore the effects of dauricine(DAU) on receptor for advanced glycation end products(RAGE) and nuclear transcription factor(NF)-κBp65 of the hippocampus in Alzheimer's disease(AD) mice.MethodsMale mice were randomly divided into control，model，donepezil (0.001 g/kg)，DAU high-dose (2.4 g/kg)，DAU medial-dose (1.2 g/kg)，DAU low-dose (0.6 g/kg) groups. The AD model mice were induced by microinjection of incubated amyloid beda1～42(2 g/L) into the dorsal blade of and intraperitoneal injection of D-galactose(180 mg/kg) in the dentale gyrus in the bilateral hippocampus. Morris water maze was used to observe the learning and memory ability of AD mice. Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) was used to determine the contents of IL-1β and IL-6. By immunohistochemistry(IHC)，real time (RT)-PCR and Western bolt were used to test the contents of RAGE and NF-κBp65 of the hippocampus in AD mice.ResultsCompared with those of model group，DAU high-dose and medial-dose significantly improved the learning and memory ability of AD mice(P<0.05). DAU high-dose and medial-dose decreased the levels of IL-1β，IL-6，RAGE and NF-κBp65 in the hippocampus(P<0.05).ConclusionsDAU could improve the ability of learning and memory of AD mice. DAU plays a certain role in the treatment of AD through inhibiting RAGE and NF-κBp65.

Dauricine；Alzheimer's disease；Receptor for advanced glycation end products

R285

A

1005-9202(2017)19-4697-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.004

国家自然科学基金(81373777，81173599)；齐齐哈尔医学院院内科研博士专项基金(QY2016B-21，QY2016B-26)；黑龙江省教育厅科学研究项目(12531788)

1 黑龙江中医药大学

费洪新(1978-)，男，博士，讲师，博士后，主要从事阿尔茨海默病、肝纤维化、肿瘤、痛风的实验研究。

张英博(1973-)，男，博士，副教授，副主任医师，主要从事阿尔茨海默病、肝纤维化、肿瘤、痛风的实验研究。