苗药黑骨藤中咖啡酰基奎宁酸类部位对人类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞MH7A增殖及炎症因子分泌的影响Δ

王霞，杨健，宋菲，董莉，刘亭，郑林，马雪，李勇军#（.贵州医科大学民族药与中药开发应用教育部工程研究中心/国家苗药工程技术研究中心，贵阳 550004；.贵州医科大学药学院，贵阳550004；.贵州医科大学贵州省药物制剂重点实验室，贵阳 550004）

·民族医药·

苗药黑骨藤中咖啡酰基奎宁酸类部位对人类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞MH7A增殖及炎症因子分泌的影响Δ

王霞1，2＊，杨健2，3，宋菲1，2，董莉2，刘亭3，郑林3，马雪1，李勇军1#（1.贵州医科大学民族药与中药开发应用教育部工程研究中心/国家苗药工程技术研究中心，贵阳 550004；2.贵州医科大学药学院，贵阳550004；3.贵州医科大学贵州省药物制剂重点实验室，贵阳 550004）

目的：研究苗药黑骨藤中咖啡酰基奎宁酸类部位（CADF）对肿瘤坏死因子α（TNF-α）诱导的人类风湿性关节炎（RA）成纤维样滑膜细胞MH7A增殖及炎症因子分泌的影响，探讨CADF抗RA的作用机制。方法：将MH7A细胞分为空白组、TNF-α模型组、甲氨蝶呤组（阳性对照，20 mg/L）和CADF不同质量浓度组（50、100、200、400 mg/L），除空白组外，其余各组均以50 μg/LTNF-α刺激活化MH7A细胞。以TNF-α与相应药物的混合液共同作用24 h后，检测细胞的增殖情况和培养液中一氧化氮（NO）、前列腺素E2（PGE2）、白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素6（IL-6）的含量。结果：与空白组比较，TNF-α模型组细胞增殖活性显著增强（P＜0.01），培养液中NO、PGE2、IL-1β、IL-6含量显著增加（P＜0.01）；与TNF-α模型组比较，各给药组细胞的增殖均受到显著抑制（P＜0.05或P＜0.01），培养液中NO、PGE2、IL-1β、IL-6含量均显著减少（P＜0.01），且与CADF具有一定的量效关系。结论：CADF可通过抑制TNF-α诱导的MH7A细胞增殖，减少炎症因子NO、PGE2、IL-1β、IL-6的分泌，从而发挥其抗RA的作用。

苗药；黑骨藤；咖啡酰基奎宁酸类部位；人类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞MH7A；炎症因子

黑骨藤为萝藦科杠柳属植物黑龙骨（Periploca forrestii Schltr.）的干燥根或全株，有通经、活血和祛风等功效，用于风湿关节痛、跌打损伤等症的治疗，被收载于《贵州省中药材、民族药材质量标准》（2003年版）中，是贵州省苗族常用药材之一[1]。临床应用结果也显示，黑骨藤及其复方制剂对风湿病和类风湿病有较好的疗效[2]。本课题组前期的研究发现，黑骨藤水溶性部位为抗类风湿性关节炎（RA）的活性部位。对黑骨藤70%乙醇提取物用大孔树脂富集、80%乙醇洗脱并进行成分分析后发现，80%乙醇洗脱部位主要含有咖啡酰基奎宁酸类成分[将该部位记为咖啡酰基奎宁酸类部位（CADF）][3]。据文献报道，咖啡酰基奎宁酸类成分具有抗氧化、抗炎等作用[4]。为探讨其抗RA活性，本研究在前期研究基础上，以黑骨藤中CADF为研究对象，考察其对人类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞MH7A的增殖及炎症因子分泌的影响，在细胞水平上探讨CADF抗RA的作用及机制，为黑骨藤的进一步开发应用提供研究基础。

1 材料

1.1 仪器

UV-2401 PC紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）；TS100倒置显微镜（日本Nikon公司）；Fresco17冷冻离心机（美国Thermo公司）；680酶标仪（上海伯乐生命医学产品有限公司）。

1.2 药材、药品与试剂

黑骨藤药材购自贵阳市万东中药材市场，经贵州医科大学药用植物学与生药学教研室龙庆德副教授鉴定为真品；注射用甲氨蝶呤（MTX，江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：16031416，规格：0.1 g/瓶）；重组人肿瘤坏死因子α（TNF-α）蛋白（美国泒普泰克公司，批号：300-01A）；3-O-咖啡酰基奎宁酸对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号：RO5F6F1，纯度：≥98%）；一氧化氮（NO）试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号：S0021-3）；前列腺素E2（PGE2，批号：20161021）、白细胞介素1β（IL-1β，批号：20161028）、白细胞介素6（IL-6，批号：20161027）酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；其他试剂均为分析纯。

1.3 细胞

人类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞MH7A购自广州吉尼欧生物有限公司（细胞来源于日本RIKEN研究所生物资源中心）。

2 方法

2.1 CADF的制备

取干燥黑骨藤药材粗粉15 kg，用70%乙醇回流提取3次，每次1.5 h，回收乙醇，干燥后得到70%乙醇提取物浸膏1 920.5 g。用水将浸膏溶解后用D101大孔树脂吸附，然后依次用水、80%乙醇洗脱，收集80%乙醇洗脱部位，回收乙醇，干燥得80%乙醇组分641.7 g，将该部位记为CADF。以3-O-咖啡酰基奎宁酸为对照品，采用紫外-可见光分光光度法对CADF中总咖啡酰基奎宁酸酯类化合物进行含量测定，含量为61.5%。将CADF用二甲基亚砜（DMSO）制备成100 g/L的母液，于－20℃条件下保存，备用。临用前用培养液稀释至所需浓度。

2.2 细胞培养

将细胞培养于含有10%胎牛血清、100 mg/L链霉素和1×105u/L青霉素的DMEM高糖培养液中，于37℃、5%CO2培养箱中培养。细胞隔天换液，每3～4天进行1次传代，选取5～10代生长良好的细胞进行后续试验。

2.3 细胞增殖抑制试验

采用MTS法测定细胞增殖活性。选取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，以含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液制成细胞密度为1×105mL－1的单细胞悬液，接种于96孔板中，每孔100 μL。将培养板置于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h，弃原培养液，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞，将试验分为空白组（空白DMEM高糖培养液）、TNF-α模型组（加入终质量浓度为50 μg/L的TNF-α溶液）、MTX组（阳性对照，加入终质量浓度为 20 mg/L MTX与50 μg/L TNF-α的混合液）及CADF不同质量浓度组（加入终质量浓度为50、100、200、400 mg/L CADF与50 μg/L TNF-α的混合液），每孔100 μL，每个质量浓度设置5个复孔。培养24 h后，弃培养液，加入新鲜培养液；每孔加入5 μL的MTS，继续培养4 h后，于酶标仪490 nm波长处测定各孔的吸光度（A）。计算细胞增殖抑制率，细胞增殖抑制率（%）＝（TNF-α模型组A值－药物组A值）/TNF-α模型组A值×100%。试验重复3次。

2.4 CADF对TNF-α诱导的MH7A细胞释放NO的影响

取对数生长期细胞，按“2.3”项下方法分组、给药，每个质量浓度平行设置3个复孔。培养24 h后，分别吸取培养液上清50 μL于酶标板中，先加入格里斯试剂Ⅰ（GriessⅠ）50 μL，然后再加入GriessⅡ 50 μL，混匀后于酶标仪540 nm波长处测定A值，按照NO试剂盒说明书操作，测定培养液中NO的含量。试验重复3次。

2.5 CADF对TNF-α诱导的MH7A细胞释放PGE2、IL-1β、IL-6的影响

取对数生长期细胞，按“2.3”项下方法分组、给药，每个质量浓度平行设置3个复孔。培养24 h后，分别吸取培养液上清，按照相应的试剂盒说明书操作，测定培养液中PGE2、IL-1β、IL-6的含量。试验重复3次。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 细胞增殖抑制率测定结果

与空白组比较，TNF-α模型组细胞明显增殖（P＜0.01）。与TNF-α模型组比较，各给药组细胞的增殖均受到明显抑制（P＜0.05）；且CADF对细胞增殖的抑制作用具有浓度依赖性，当CADF质量浓度为400 mg/L时，其对细胞的增殖抑制率达30.8%，结果见表1。

表1 各组细胞增殖抑制率测定结果（±s，n＝3）Tab 1 Determination results of cell proliferation inhibitory rate in each group（±s，n＝3）

表1 各组细胞增殖抑制率测定结果（±s，n＝3）Tab 1 Determination results of cell proliferation inhibitory rate in each group（±s，n＝3）

注：与空白组比较，＊＊P＜0.01；与TNF-α模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.blank group，＊＊P＜0.01；vs.TNF-α model group，#P＜0.05，##P＜0.01

组别空白组TNF-α模型组MTX组CADF 50 mg/L组CADF 100 mg/L组CADF 200 mg/L组CADF 400 mg/L组增殖抑制率，%16.4 8.3 16.5 18.5 30.8 A值0.652±0.029 0.734±0.028＊＊0.613±0.013##0.673±0.022#0.613±0.012##0.598±0.013##0.508±0.017##

3.2 培养液中NO、PGE2、IL-1β、IL-6含量的测定结果

与空白组比较，TNF-α模型组细胞培养液中NO、PGE2、IL-1β、IL-6含量均显著增加（P＜0.01）；与TNF-α模型组比较，各给药组细胞培养液中NO、PGE2、IL-1β、IL-6含量均显著减少（P＜0.01），并呈现较好的浓度依赖性，结果见图1。

图1 各组细胞培养液中NO、PGE2、IL-1β、IL-6含量测定结果（±s，n＝3）Fig 1 Determination results of NO，PGE2，IL-1β and IL-6 contents in culture medium in each group（±s，n＝3）

4 讨论

RA是一种常见的慢性全身性自身免疫性疾病[5]。RA的病理特点就是滑膜长期的慢性炎症，并逐渐增生成血管翳，造成骨与软骨的破坏，晚期还可导致关节强直、畸形甚至残疾[6-7]。滑膜增生是RA病理过程中的一个重要特征，其侵蚀骨与软骨后直接导致关节功能障碍，特点是产生肿瘤样增殖。故有研究认为，抗滑膜细胞增殖可能是一种有效治疗RA的手段[8]。

原代RA滑膜细胞RAFLSs来源有限，受代数限制，用于科研有一定困难。MH7A细胞属于RAFLSs的一种成熟细胞系，该细胞具有增殖速度快、可多次传代、贴近病患体内状态等特点[9-10]。因此，本研究选择MH7A细胞作为RA研究的细胞模型。在前期预试验中，本课题组考察了6.25、12.5、25、50、100、200、400、800、1 000 mg/L的CADF对MH7A细胞增殖的影响。结果，当CADF质量浓度低于50 mg/L时，其对MH7A细胞增殖无明显影响；当CADF质量浓度高于400 mg/L时，其对MH7A细胞增殖有非常明显的抑制作用；当CADF质量浓度在50～400 mg/L时，对细胞增殖的抑制具有浓度依赖性。故在本研究中设置50、100、200、400 mg/L这4个药物浓度进行考察。

TNF-α是RA中重要的细胞因子之一，可使细胞产生肿瘤样增殖，并产生大量的炎症因子[11]。IL-1β是促使RA免疫应答放大，并转为破坏反应的主要细胞因子。IL-6是一种重要的炎症细胞因子，与RA的发展有关。NO是炎症反应与免疫调节的效应因子，在炎症级联反应中起着关键的调节作用；其还能促进PGE2、IL-1β、TNF-α等炎症因子的释放，当产生过量炎症因子时则会导致一系列的炎性损伤。其中，PGE2作为第三信使，是炎症反应的重要介质，炎症的发生发展与局部PGE2的含量密切相关[12]。本研究结果显示，50 μg/L的TNF-α可明显诱导MH7A细胞增殖，促进细胞分泌细胞因子NO、PGE2、IL-1β、IL-6。50～400 mg/L的CADF对细胞增殖和炎症细胞因子的分泌均有明显的抑制作用，且具有浓度依赖性。

综上所述，CADF可呈浓度依赖性地抑制MH7A细胞的增殖，抑制细胞因子NO、PGE2、IL-1β、IL-6的分泌，这可能是其抗RA的作用机制之一，但其更多的作用机制还有待进一步研究。

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Effects of Caffeoylquinic Acid Derivative Fractions in Miao Medicine Periploca forrestii on Proliferation and Secretion of Inflammatory Cytokines in Human Rheumatoid Arthritis Fibroblast-like Synoviocytes MH7A

WANG Xia1，2，YANG Jian2，3，SONG Fei1，2，DONG Li2，LIU Ting3，ZHENG Lin3，MA Xue1，LI Yongjun1（1.Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicine and TCM，Ministry of Education/National Engineering Research Center of Miao Medicines，Guizhou Medical University，Guiyang 550004，China；2.School of Pharmacy，Guizhou Medical University，Guiyang 550004，China；3.Guizhou Provincial Key Laboratory of Preparations，Guizhou Medical University，Guiyang 550004，China）

OBJECTIVE：To study the effects of caffeoylquinic acid derivative fractions（CADF）in Miao medicine Periploca forrestii on proliferation and secretion of inflammatory cytokines in tumor necrosis factor α（TNF-α）-induced human rheumatoid arthritis（RA）fibroblast-like synoviocytes MH7A，and explore its mechanism on anti-RA.METHODS：MH7A cells were divided into blank group，TNF-α model group，methotrexate group（positive control，20 mg/L）and CADF different mass concentrations groups（50，100，200，400 mg/L）.Except for blank group，other groups

50 μg/L of TNF-α to stimulate MH7A cells.After treated by suspension with TNF-α and related medicines for 24 h，the cell proliferation and contents of nitric oxide（NO），prostaglandin E2（PGE2），interleukin 1β（IL-1β），interleukin 6（IL-6）in culture medium were detected.RESULTS：Compared with blank group，cell proliferation activity in TNF-α model group was significantly enhanced（P＜0.01），contents of NO，PGE2，IL-1β，IL-6 in culture medium were significantly increased（P＜0.01）.Compared with TNF-α model group，cell proliferation in each administration group were significantly inhibited（P＜0.05 or P＜0.01），contents of NO，PGE2，IL-1β，IL-6 in culture medium were significantly decreased（P＜0.01），showing certain dose-effect relationship with CADF.CONCLUSIONS：CADF can play the role in anti-RA by inhibiting the TNF-α-induced proliferation of MH7A cells and reducing the secretion of inflammatory cytokines NO，PGE2，IL-1β，IL-6.

Miaomedicine； Periplocaforrestii； Caffeoylquinic acid derivative fractions；Human rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes MH7A；Inflammatory cytokines

R285.5

A

1001-0408（2017）28-3949-04

2017-03-04

2017-07-14）

（编辑：林 静）

国家自然科学基金资助项目（No.81460641、81660691）；贵州省优秀青年科技人才培养对象专项资金项目（No.黔科合人字〔2015〕11号）；贵州省科技计划项目（No.黔科合平台人才〔2016〕5677、黔科合平台人才〔2016〕5613）；贵州省协同创新中心建设项目（No.黔教合协同创新字〔2013〕04）；贵州省研究生卓越人才计划项目（No.ZYRC2014012）

＊硕士研究生。研究方向：中药药效物质与质量控制。电话：0851-86908468。E-mail：948015901@qq.com

#通信作者：教授，硕士生导师，硕士。研究方向：中药药效物质与质量控制。电话：0851-86908468。E-mail：liyongjun026@126.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.28.17