同位素稀释质谱法在美国CDC-CRMLN计划中的比对结果分析*

周伟燕 ，李红霞，张传宝，杨睿悦，张江涛，张天娇，闫颖，曾洁，王抒，陈文祥，董军

(北京医院 国家老年医学中心，a.卫生部临床检验中心，b.卫生部老年医学重点实验室，北京 100730)

·质量管理研究·

同位素稀释质谱法在美国CDC-CRMLN计划中的比对结果分析*

周伟燕a，李红霞b，张传宝a，杨睿悦b，张江涛a，张天娇a，闫颖a，曾洁a，王抒b，陈文祥a，董军b

(北京医院 国家老年医学中心，a.卫生部临床检验中心，b.卫生部老年医学重点实验室，北京 100730)

目的总结并回顾性分析同位素稀释质谱法在美国疾病预防控制中心(CDC)胆固醇参考方法实验室网络(CRMLN)中的比对结果，为我国血脂测定提供质量保证。方法采用我国建立的同位素稀释液相色谱串联质谱(ID-LC/MS/MS)测定血清总胆固醇(TC)和三酰甘油(TG)的方法参加CRMLN比对。2016年之前每3个月1次，每次4种样品，测定2批。2016年之后每半年比对1次，每次4种样品，测定2批。每次测定中至少同时测定2个有证标准物质作为质控品。结果15次TC比对结果显示，本血脂参考实验室(以下简称“本室”)平均CV为0.43%，CDC各参加实验室间CV为0.42%，本室与实验室间总体均值的偏移为0.22%，与CDC靶值的偏移为0.58%。15次TG比对结果显示，本室平均CV为0.62%，本室测定TG的结果与实验室间均值的偏移为-0.98%，与CDC靶值的偏移为-0.80%。TC和TG各60个比对结果中，98%(59/60)的TC测定CV满足CDC的精密度要求，70%(42/60)的测定满足TC准确度要求(TC：CV≤1%，偏移≤1%)；92%(55/60)的TG测定准确度满足CDC的要求(TG：偏移≤2.55%)。结论ID-LC/MS/MS测定血清TC和TG的方法在CRMLN比对中数据良好，与CDC及各网络实验室测定结果一致，有望在我国血脂标准化中发挥重要作用并为参考测量比对计划提供经验和技术支持。

美国疾病预防控制中心；胆固醇参考方法实验室网络；胆固醇；三酰甘油；同位素稀释液相色谱串联质谱

Abstract：ObjectiveTo summarize and review the comparative results of the isotope dilution mass spectrometry in Cholesterol Reference Method Laboratory Network (CRMLN)project of the Centers for Disease Control and Prevention (CDC)of the United States in order to provide quality controls for determination of blood lipid.MethodsThe isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry (ID-LC/MS/MS)methods for determination of serum total cholesterol (TC)and triglycerides (TG)were developed to participate in the comparison of CRMLN. The survey was conducted every three months before 2016 and every half year from 2016. Four kinds of reference materials with two parallel tubes for each material and each tube in duplicate were determined in every survey. At least two certified reference materials used as quality control samples were analyzed simultaneously in each determination.ResultsIn the 15 comparisons theCVof the TC determination method in our laboratory was 0.43% while theCVof all the participated laboratories in CRMLN was 0.42%. Thebiasfrom the overall mean value in our laboratory was 0.22% while thebiasfrom the CDC target values was 0.58%. TheCVof the TG determination method in 15 tests of our laboratory was 0.62% and thebiaswas -0.98% from the overall mean value and -0.80% from the target values of CDC. Among the 60 results for comparison, 98% (59/60)ofCVin the TC determination met with CDC requirement for precision (CV≤1%), and 70% ofbias(42/60)of the results met with CDC requirement for accuracy (bias≤1%). For the 60 results in comparison of TG determination, 92% (55/60)ofbiasof the results met with the accuracy requirement of CDC (bias≤2.55%).ConclusionIn CRMLN comparison the results of TC and TG determined by ID-LC/MS/MS method were consistent with the values which were certified by CDC and determined by other network laboratories. The comparative surveys may play an important role in the standardization of lipid determination, and should be expected to provide experiences and technical supports in the comparative plan for reference measurement in our country.

Keywords：Centers for Disease Control and Prevention; Cholesterol Reference Method Laboratory Network; cholesterol; triglycerides; isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry

“标准化计划”是将常规测定结果与参考方法相联系的过程，是指通过一级参考物质和/或参考测量程序使结果溯源至SI单位制。目前全球范围内最有影响力的标准化计划之一就是美国疾病预防控制中心(Centers for Disease Control and Prevention，CDC)的血脂标准化计划[1-2]。该计划最初通过参考方法定值的血清参考物质进行量值传递与溯源。但由于参考物质代表性有限，且很多需要经过样品制备如冻干，使其性质发生改变，在很多分析系统上不具有互通性。1989年CDC建立了胆固醇参考方法实验室网络(cholesterol reference method laboratory network，CRMLN)[3]组织，定期参考比对，为血脂试剂生产厂家和临床实验室提供分析系统溯源认证服务。本血脂参考实验室(以下简称“本室”)1992年成为该网络实验室成员，用CDC的参考方法测定总胆固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)等。2012年4月CDC开展了同位素稀释质谱(isotope dilution mass spectrometry,ID-MS)测定TC、三酰甘油(triglycerides，TG)的比对计划。

ID-MS技术是国际物质量咨询委员会公布的基准测量原理之一，在临床检验领域发展迅速。近些年基于ID-MS技术建立了许多项目的参考方法。本室也分别建立了同位素稀释气相色谱质谱(isotope dilution gas chromatograpy mass spectrometry，ID-GC/MS)、同位素稀释液相色谱质谱(isotope dilution liquid chromatograpy tandem mass spectrometry，ID-LC/MS/MS)测定血清TC[4-5]、总甘油[6]和游离甘油的参考方法。本室用建立的ID-LC/MS/MS方法参加了CRMLN的参考实验室比对，成为CDC第一批质谱方法网络实验室。

本研究汇总ID-LC/MS/MS方法检测TC和TG的比对结果，并介绍近几年TC和TG的方法比对情况。

1 材料与方法

1.1化学试剂 胆固醇纯度标准物质GBW 09203b(卫生部老年医学研究所)，纯度为(99.7±0.1)%。甘油一级标准物质GBW09149(溶液状态)，认定值为(0.103 6±0.000 4)g/g。同位素内标为[25，26，27-13C3]胆固醇和[13C3]甘油(均购自美国Cambridge Isotope公司)，标示同位素丰度均大于99%。常温密封保存。

1.2血清样品 所测定的评价样品为美国CDC提供的新鲜冰冻人血清样品，通过冷链运输至实验室。质控血清为我国血脂一级血清标准物质GBW09178a～GBW180a、GBW09178b～GBW180b，国际有证标准物质SRM909b、SRM909c、SRM1951b。每次测定至少分析2个质控物质。

1.3仪器设备 主要分析仪器是液相色谱串联质谱联用系统(LC/MS/MS)，包括Agilent 1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司)、API 4000串联三重四极杆质谱仪和Analyst 1.4.2数据处理软件(美国Applied Biosystems公司)。样品制备使用的主要仪器包括十万分之一天平(美国Sartorius公司)、MicroLab 500型稀释器(美国Hamilton公司)。

1.4方法 采用ID-LC/MS/MS法测定TC，该法已列入国际临床化学会(International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine，IFCC)参考方法列表，为国际公认的参考方法[4-5]。用ID-LC/MS/MS测定总甘油[6]和游离甘油，两者之差即为TG结果。其他实验室测定TG的方法包括酶法和化学法直接测定TG、ID-GC/MS法测定总甘油和游离甘油(两者之差为TG)、ID-GC/MS法测定总甘油。由于TG测定方法和原理不统一，比对数据存在一定差异，本研究介绍的TG比对结果均为总甘油结果。

1.5参加实验室 CDC官网上列出的能提供血脂标准化服务的网络实验室有8家，2016年7月份又有2家实验室加入网络实验室，但尚未在提供服务的列表中。CRMLN网络实验室参加的项目及提供的服务[7]见表1。

1.6测定过程 2012年4月至2015年12月，CDC每年发放下一年度比对样品。每个季度测定1次，每次4种样品，每种样品2个平行管，分2批盲样测定。每批每个样品测定2次，即每种样品有4个结果。2016年1月至今，改为每半年测定1次，每次4种样品，分2批盲样测定。本室每次测定均分析至少2个有证参考物质作为质控样品，质控样品的偏移满足本室的要求(TC偏移≤1%，TG偏移≤1.5%)则认为该次测定值有效。

1.7数据处理和统计学分析 对于每个比对样品，各网络实验室均向CDC报告4个结果，CDC将4个结果的均值作为该实验室的最终测定值，计算标准差(s)和CV，并分析各实验室的结果，计算实验室间均值作为组内均值。CDC靶值的定值方法如下：TC，ID-GC/MS；总甘油，ID-GC/MS；TG，化学法；游离甘油，以上总甘油和TG的差值。CDC靶值的数据处理方法未知。CDC设定的网络实验室的质量指标如下：TC的偏移和CV均为1%，2016年之前总甘油和TG的偏移和CV均为3%，2016年7月以后取消TG，只评价总甘油。根据多年来各实验室测定结果的情况，将判定标准改为单个样品的偏移±2.55%，4种样品平均偏移±2.00%，单个样品的偏移范围(最大偏移与最小偏移的差值，n=4)≤3.95%，4种样品平均偏移范围(最大偏移与最小偏移的差值，n=16)≤6.96%。本室所有数据处理均在EXCEL2007上完成。

表1 CRMLN网络实验室成员及比对项目

注：*，暂不提供分析系统认证服务；“-”，不参加；Y，参加;AK,Abell-Kendall法；UC，超速离心法；DCM,硫酸葡聚糖镁离子沉淀法。

2 结果

2.1TC测定结果 2012年4月至2015年12月，每3个月测定2次，一年测定4次；2016年1月至今，每半年测定1次。至今一共18次TC结果比对，2014年4、7月，2015年4月由于样品清关等问题本室没有参加TC比对，实际考核15次。总结和汇总15次TC比对结果，共有60个样品，240个结果。结果显示，本室内TC平均CV为0.43%(0.1%～1.1%)，CDC各网络实验室间CV为0.42%(0.1%～1.7%)，本室与实验室间均值(组内均值)的偏移为0.22%(-0.9%～1.4%)，与CDC靶值的偏移为0.58%(-0.8%～2.2%)。本研究将本室测定值与组内均值和CDC靶值进行线性回归分析，本室测定值与CDC靶值和组内均值均具有良好的相关性，相关系数(r)均大于0.999 7，两条回归直线几乎重合，说明对于TC项目实验室间测定结果与CDC靶值一致。

比对计划以盲样形式测定，但在15次比对中有12个比对样品重复出现，重复出现的次数为2～6次，分析这些样品的测定数据，计算同一样品多次测定的均值和CV，结果显示本室测定的平均CV为0.54%(0.20%～1.00%)，与组内均值的平均偏移为0.30%(-0.21%～0.75%)，与CDC靶值的平均偏移为0.60%(-0.31%～1.48%)，结果见表2。

CDC汇总了网络实验室ID-MS法测定TC的18次结果，计算实验室组均值与CDC靶值的偏移和实验室间CV，结果显示除2016年2次比对的偏移略大于CDC的偏移指标1%之外，其他均在1%以内；18次结果的CV均小于0.7%。见图1。

表2 TC比对样品重复测定的结果

图1 2012年4月至2016年7月CRMLN计划TC测定结果的偏移图和CV图

2.2总甘油测定结果 与TC一样，总甘油测定一共18次比对，实际考核15次。本研究总结和汇总15次总甘油比对结果，共有60个样品，240个结果。结果显示，本室总甘油CV为0.62%(0.2%～1.5%)，本室测定结果与组内均值的偏移为-0.98%(-3.5%～2.3%)，与CDC靶值的偏移为-0.80%(-4.2%～2.9%)。18个样品CDC没有提供TG靶值，因此不做评价。本研究将本室测定值与组内均值和CDC靶值进行线性回归分析，本室总甘油测定值与CDC靶值和组内均值均具有良好的相关性，r均大于0.999 5，两条回归直线几乎重合，说明对于TC项目实验室间测定结果与CDC靶值一致。

在18次比对中有13个比对样品重复出现，重复出现的次数为2～8次，计算同一样品多次测定的均值和CV，结果显示本室测定的平均CV为1.04%(0.33%～1.59%)，与组内均值的平均偏移为-0.86%(-0.23%～1.74%)，与CDC的平均偏移为-0.73%(-1.92%～2.35%)，结果见表3。

CDC汇总网络实验室ID-MS法测定总甘油的结果，计算实验室组均值同CDC靶值的偏移和实验室间的CV，结果显示17次比对的偏移均小于CDC的偏移指标2%；16次结果的CV均小于1%。见图2。

表3 总甘油比对样品重复测定的结果

图2 2012年4月至2016年7月CRMLN计划总甘油测定结果的偏移图和CV图

3 讨论

目前全球范围内最有影响力的标准化计划主要是始于1957年美国CDC的血脂标准化计划[1-3]、1993年美国临床化学协会的美国国家糖化血红蛋白标准化计划[8-10]和1995年IFCC开始的糖化血红蛋白标准化计划[11-12]。其中血脂标准化计划是开展最早、影响最大、最有成效的一项标准化计划。TC标准化计划开始之初主要针对TC项目，后来发展为包括TC、TG、HDL-C和LDL-C，主要通过参考方法定值的冰冻血清参考物质传递其准确性。为克服参考物质代表性差、缺乏互通性等问题，并方便全球实验室进行血脂标准化，1989年建立了CRMLN，全球有资质的血脂参考实验室可通过考核成为网络实验室一员。CRMLN主要包括两部分，一部分针对参加计划的网络参考实验室，定期进行参考比对，另一部分针对厂家和临床实验室，临床实验室和厂家可就近选择其网络实验室进行分析系统认证。此计划在国际血脂标准化中发挥着重要作用。

CRMLN比对的项目包括AK法测定TC[13]、ID-MS法测定TC、TG比对(ID-MS法、酶法、化学法[14])、指定比对方法测定HDL[15](硫酸镁葡聚糖镁离子沉淀法，也称DCM法)、超速离心化学沉淀法测定HDL[16]、超速离心化学沉淀法(即β定量法)测定LDL[17]。TC的AK法是上世纪CDC建立的TC参考方法，在国际上影响力很大，至今为止很多TC分析系统仍溯源到此参考方法。ID-MS方法是近些年建立起来的参考方法，研究显示AK法由于方法特异性的问题，检测的血清TC中包括一些植物甾醇，比ID-MS检测结果平均高1.6%[18]。2012年至今，CDC共进行了18次TC比对，共72个样品，AK法和ID-MS法比对平行进行，CDC分别采用AK法和ID-GC/MS法对两种比对样品进行靶值测定。经统计，这些比对样品AK法靶值与ID-MS法靶值的平均偏移为1.48%(-0.2%～-2.8%)。尽管ID-MS法检测结果更加准确可靠，但是由于很多流行病学研究、参考区间研究、分析系统溯源都是基于AK法，因此AK法仍是美国CDC系统中TC测定的经典参考方法。2012年4月CDC开展了ID-MS测定TC和TG的比对，本室成为其质谱测定的首批网络实验室，采用ID-LC/MS/MS法参加了近几年比对。TC-ID-MS项目中，现有5家国际实验室参加，除本室之外均采用ID-GC/MS方法。该项目的质量指标与判定标准与TC-AK法相同，偏移±1%，CV≤1%。所有实验室5年的比对数据显示，除2016年两次比对的偏移略大于CDC的偏移指标1%之外，其他均在1%以内；17次结果的CV均小于0.7%。

CRMLN中TG是唯一一个没有指定比对方法的项目，参加比对的方法有酶法、化学法、ID-MS法，测定分析物包括总甘油、TG、游离甘油，CDC对这3个分析物的靶值测定方法为用ID-GC/MS法测定总甘油，化学法测定TG，两者的差值为游离甘油。参加实验室采用酶法或化学法直接测定TG，或采用总甘油和游离甘油的差值进行测定。比对结果显示，本室TG测定值与组内均值的偏移为-2.4%(-6.59%～0)，与CDC靶值的偏移为-2.6%(-5.72%～0.92%)。由于TG的测定方法原理不同，因此CRMLN中TG的比对结果不太理想。另外,考虑到临床检验领域TG的测定大都测定的总甘油，2016年7月起CRMLN取消了TG比对，只对总甘油进行比对。现有6家国际实验室参加，美国西北脂类和糖尿病研究实验室采用酶法，加拿大实验室采用化学法，其他4家实验室采用ID-MS方法。该项目的质量指标与判定标准改为单个样品的偏移±2.55%，4种样品平均偏移±2.00%，单个样品的偏移范围(最大偏移与最小偏移的差值，n=4)≤3.95%，4种样品平均偏移范围(最大偏移与最小偏移的差值，n=16)≤6.96%。

CRMLN比对的结果表明，越来越多的实验室采用ID-MS方法参加该计划，比对结果显示各实验室间测定结果可满足CDC的分析质量要求，精密度好、准确度高，测定结果可靠、可比。CRMLN模式发展至今近30年，具有很多的优势，为全球血脂标准化和溯源提供了重要的质量保证。我国室间质评计划中的参考测量比对可借鉴CRMLN的成功的经验，有望为我国临床检验领域重要常规检验项目提供方便、准确、可靠的溯源基础和保障。

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AnalysisforcomparativeresultsofisotopedilutionmassspectrometryinCDC-CRMLNproject

ZHOUWei-yana,LIHong-xiab,ZHANGChuan-baoa，YANGRui-yueb,ZHANGJiang-taoa,ZHANGTian-jiaoa,YANYinga,ZENGJiea,WANGShub,CHENWen-xianga,DONGJunb

(a.NationalCenterforClinicalLaboratories;b.TheKeyLaboratoryofGeriatrics,BeijingInstituteofGeriatrics,NationalCenterofGerontology,BeijingHospital,Beijing100730,China)

R446

A

2017-07-05)

(本文编辑王海燕)

国家自然科学基金(81201337，81472035)；国家科技基础性工作专项(2013FY113800)；北京生物医药产业跨越发展工程项目(G20工程，Z161100001816043)。

周伟燕，1982年生，女，副研究员，博士，主要从事临床化学质量控制与标准化研究。

董军，研究员，博士研究生导师，E-mail：jun_dong@263.net。

10.13602/j.cnki.jcls.2017.09.13