2型糖尿病及其微血管并发症患者血清miR-661水平变化及其辅助诊断价值*

王静，王成，万淑君，李丹丹，张春妮，汪俊军

(南京军区南京总医院临床检验科，南京 210002)

·临床实验研究·

2型糖尿病及其微血管并发症患者血清miR-661水平变化及其辅助诊断价值*

王静，王成，万淑君，李丹丹，张春妮，汪俊军

(南京军区南京总医院临床检验科，南京 210002)

目的观察2型糖尿病(T2DM)及其微血管并发症(T2DMC)患者血清miR-661水平变化并分析其临床辅助诊断价值。方法用实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)检测60例T2DM患者、60例T2DMC患者及60例健康对照者血清中miR-661水平，同时测定空腹血糖(FPG)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和糖化血红蛋白(HbA1c)等指标水平，ROC曲线、相关性分析及Logistic regression分析血清miR-661对T2DM及T2DMC的诊断价值。结果qRT-PCR结果显示，T2DM患者和T2DMC患者血清miR-661相对含量[中位数(四分位数)][M(P25，P75)]分别为230.1(83.6，426.2)fmol/L和441.3(212.9，1 021.0)fmol/L，与健康人对照组的118(63.6，192.4)fmol/L相比，均升高(U值分别为1 207和435，P均<0.01)；血清miR-661 T2DM的ROC曲线下面积(AUCROC)为0.665(95%CI=0.565～0.765，P<0.01)，T2DMC的AUCROC为0.879(95%CI=0.821～0.938，P<0.01)，区分T2DM及T2DMC的AUCROC为0.694(95%CI=0.600～0.788，P<0.01)；相关性分析结果显示血清miR-661水平与FPG和LDL-C呈正相关(r值分别为0.291和0.149，P均<0.05)，与HDL-C呈负相关(r为-0.243，P<0.01)；进一步用单因素和多因素Logistic regression分析结果显示，血清miR-661是T2DM和T2DMC的独立危险因素(P均<0.01)。结论血清中表达升高的miR-661是T2DM及T2DMC患者潜在辅助诊断标志物及独立危险因素。

2型糖尿病；微血管并发症；微小核糖核酸；血清；生物标志物

Abstract:ObjectiveTo investigate the serum levels of miR-661 in type 2 diabetes(T2DM)patients and type 2 diabetes with microvascular complications(T2DMC), and to further evaluate its clinical auxiliary diagnosis significance.MethodsThe serum levels of miR-661 were examined in 60 T2DM patients, 60 T2DMC patients and 60 healthy controls using quantitative real-time PCR(qRT-PCR). The sera levels of biochemical parameters including fasting plasma glucose(FPG), cholesterol(TC), triglycerides(TG), low density lipoprotein(LDL-C), high density lipoprotein(HDL-C)and haemoglobinA1C(HbA1c)were determined by biochemical analyzer. The ROC curve analysis, correlation analyses and logistic regression analyses were performed to evaluate the clinical auxiliary diagnosis value of serum miR-661, respectively.ResultsThe qRT-PCR results showed that the concentrations of miR-661 was 118(63.6,192.4)fmol/L in healthy controls, which were significant lower than those of T2DM patients[230.1(83.6,426.2)fmol/L,(U=1 207，P<0.01)]and T2DMC patients[441.3(212.9,1 021)fmol/L,(U=435，P<0.01)]. ROC curve(AUCROC)of miR-661 was 0.665( 95%CI: 0.585～0.765,P<0.01)for T2DM patients and 0.879( 95%CI: 0.821 ～ 0.938,P<0.01)for T2DMC patients. The AUCROCbetween T2DM and T2DMC patients was 0.694(95%CI: 0.600～0.788,P<0.01). The correlation analyses revealed that the levels of miR-661 was positively correlated with concentrations of FPG(r=0.291,P<0.05)and LDL-C(r=0.149,P<0.05), and negatively correlated with concentrations of HDL-C(r=-0.243，P<0.01). Logistic regression analysis revealed that serum miR-661 was an independent risk factor in T2DM and T2DMC(P<0.01).ConclusionSerum miR-661 was potential biomarker and risk factor for T2DM and T2DMC.

Keywords: type 2 diabetes; microvascular complications; microRNA; serum; biomarkers

2型糖尿病(type 2 diabetes，T2DM)发病机制目前尚不完全清楚。随着患病时间延长，T2DM患者发生微血管病变(type 2 diabetes microvascular complications，T2DMC)几率上升，但目前临床尚缺乏有效诊断T2DMC的血清生物标志物。

微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是一类非编码单链小RNA分子，可通过与靶信使RNA 3′端非翻译序列完全或部分互补结合调控靶基因表达[1]。研究显示，miRNA与β细胞功能、胰岛素分泌和T2DM发生发展密切相关[2]。研究发现，miR-661可参与胰岛素合成及调节，与血管内皮细胞功能及内皮细胞向间充质细胞转化密切相关，提示其可能与T2DM及T2DMC发生发展密切相关[3-4]。人血清/血浆中含有大量稳定表达的miRNA，其对T2DM临床价值目前尚不清楚，但相关研究较少。本研究检测了T2DM及T2DMC患者血清中miR-661的表达水平，探讨其作为T2DMC辅助诊断的生物标志物的可能性，为T2DM及其微血管并发症的诊断和发病机制探讨提供新的思路。

1 材料和方法

1.1研究对象 收集2013年9月至2015年5月南京总医院内分泌科T2DM患者。T2DM患者(包括微血管并发症患者)按照WHO制定的标准入选：即FPG≥7.0 mmol/L和/或75 g口服葡萄糖耐量试验(OGTT) 2 h血糖≥11.1 mmol/L和/或糖化血红蛋白(HbA1c)≥6.5%；T2DMC纳入标准：患有T2DM并被确诊有糖尿病肾病或/和糖尿病神经病变或/和糖尿病视网膜病变。T2DM患者60例，其中男39例，女21例，年龄18～74岁，平均年龄47.8岁；T2DMC患者60例，其中男47例，女13例，年龄22～93岁，平均年龄51.7岁。T2DM及T2DMC患者排除标准：一个月内使用过降糖药物治疗、肝脏疾病、慢性肾功能不全、患有其他内分泌疾病及最近一个月内做过大型外科手术。健康对照者为在我院体检人群，其中男40例，女20例，年龄34～88岁，平均年龄48.9岁。纳入标准为：3年内无手术或重大疾病史，各项体检指标包括体格检查、血液学检验、体液检验、影像学检查等均正常。

1.2标本采集与保存 采集患者入院时(新发或一个月内未使用任何降糖药物)及健康对照者空腹静脉血5 mL，室温1 500×g离心5 min，收集血清标本于-80 ℃保存，采集研究对象静脉血2.5 mL,肝纳素抗凝。

1.3仪器及试剂 LightCycler®480Ⅱ实时荧光定量PCR(qRT-PCR)仪(美国Roche公司)；2720型PCR仪、miRNA测定用TaqMan探针(美国ABI公司)；WH-851型涡旋仪(南京大学)，1612-1型高速离心机(上海医疗器械公司)；5418型高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；SAS67120型超纯水机(法国Millipore公司)；7600型全自动生化分析仪(日本Hitachi公司)；HLC-723GB HbA1c检测全自动分析仪及其配套试剂(日本TOSOH公司)；酸性水饱和酚、DEPC水(美国Sigma公司)；分析纯氯仿、异丙醇、无水乙醇(上海化学试剂公司)；miRNA逆转录试剂盒、qRT-PCR检测试剂盒(大连TaKaRa公司)；人工合成的miRNA成熟体(上海Invitrogen公司)；空腹血糖(FPG)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)检测试剂(英国Randox公司)；低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)检测试剂(日本积水医疗株式会社)。

1.4生化指标测定 用配套的校准品校准仪器，校准通过、质控在控后用7600型全自动生化分析仪通过酶法测定血清FPG、TC、TG、LDL-C、HDL-C水平。用HLC-723GB HbA1c检测全自动分析仪通过离子交换高效液相色谱法(high performance liquid chromatography)测定HbA1c。

1.5血清RNA提取及实时荧光定量PCR 用课题组前期建立和优化的酸性苯酚-氯仿一步抽提法提取血清RNA[5]。RNA提取后溶于20 μL DEPC水并保存于-80 ℃待用。血清miRNA逆转录反应总体系为10 μL，包括DEPC水3.5 μL，5×AMV缓冲液2 μL，dNTP 1 μL，逆转录引物1 μL，MV逆转录酶0.5 μL，RNA 2 μL。逆转录反应参数：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，4 ℃保存。qRT-PCR总反应体系为20 μL，包括ddH2O 14.77 μL、10 × PCR缓冲液2 μL、25 mmol/L MgCl21.2 μL、10 mmol/L dNTPs 0.4 μL、Taq聚合酶0.3 μL、miRNA检测引物及探针0.33 μL、cDNA 1 μL。qRT-PCR反应参数为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min(收集荧光)，共40个循环。miRNA检测均设置3复孔，结果取均值。同时以DEPC处理的不含cDNA模板的ddH2O作为阴性对照。血清miRNA定量尚缺乏合适、通用内参基因，我们在RNA提取过程中加入20 μL 106fmol/L人工合成的外源植物MIR2911(序列为5′-GGCCGGGGGACGGGCUGGGA-3′)作为外参，用于校正RNA提取效率和误差，并将待测miRNA与MIR2911同时检测，扩增结束后根据扩增曲线设定统一的阈值，用仪器自带SDS 2.0分析软件分析扩增曲线，获得待测miRNA和外参MIR2911的Ct值。根据待测miRNA和MIR2911的Ct值计算待测样本及对照中血清miR-661的相对表达量，计算公式为2-ΔCt，其中ΔCt=Ct待测miRNA-CtMIR2911。

2 结果

2.1临床资料及血生化指标测定结果 患者组年龄、性别与对照组差异无统计学意义，但两组患者BMI、舒张压和收缩压则高于健康人对照组(P<0.01)。生化指标测定结果见表1，两组糖尿病患者FPG、HbA1c、TG均高于健康人对照组(P均<0.01)，而HDL-C则低于健康人对照组(P<0.01)，T2DMC患者LDL-C高于健康人对照组(P<0.01)。

表1 糖尿病及糖尿病微血管患者临床资料及血生化测定结果

注：a，T2DM与对照比较；b，T2DMC组与对照比较；c，T2DMC组与T2DM比较。

2.2血清miR-661检测 qRT-PCR检测结果显示，T2DM患者和T2DMC患者血清miR-661相对含量[M(P25，P75)]分别为230.1(83.6,426.2)fmol/L和441.3(212.9,1 021.0)fmol/L，与健康人对照组118(63.6,192.4)fmol/L相比均升高，U值分别为1 207和435，差异具有统计学意义(P<0.01)。

2.3miR-661辅助诊断T2DM及T2DMC 的ROC曲线分析结果 miR-661诊断T2DM的ROC曲线下面积(AUCROC)为0.665(95%CI=0.565～0.765，P<0.01)；诊断T2DMC的AUCROC为0.879(95%CI=0.821～0.938，P<0.01)；鉴别T2DM及T2DMC的AUCROC为0.694(95%CI=0.600～0.788，P<0.01)。

2.4相关性分析 对血清miR-661的水平和其他生化指标相关性分析结果显示，血清miR-661水平与FPG和LDL-C呈正相关，r值分别为0.291和0.149，P均<0.05，与HDL-C呈负相关，r值为-0.243，P<0.01，但与TC和TG无相关性，r值分别为-0.096和0.091，P均>0.05。

2.5逻辑回归分析 单因素分析结果显示，当以健康对照为二分类参考变量时，miR-661是T2DM和T2DMC独立危险因素。进一步多因素回归分析校正年龄、性别、BMI、血压及吸烟等因素后发现，当以健康人对照组为参考变量时，miR-661仍是T2DM和T2DMC患者潜在的独立危险因素，逻辑回归分析结果见表2。

表2 血清miR-661单因素及多因素逻辑回归分析

注：模型1中二分类参考变量为健康对照组；模型2中二分类参考变量为T2DM组。

3 讨论

研究显示，miRNA可作为T2DM的生物标志物[6]。然而，目前临床上仍无理想的生物标志物用于预测T2DMC。miRNA通过对基因转录后水平的调控，参与包括糖尿病等多种疾病的发生发展过程[7]。miRNA亦被报道广泛参与炎症反应、氧化应激及纤维化等微血管并发症发生的重要病理过程，进一步提示miRNA在血管功能紊乱及微血管并发症发生发展中可能发挥重要作用[8-9]。

细胞外miRNA可稳定存在于血循环中，是T2DM潜在的生物学标志物[10-11]。Kong等[12]发现，与糖尿病前期患者及糖耐量正常的糖尿病高危患者相比，7个miRNAs在新发糖尿病患者血清中水平明显增高。Zhang等[13]和Liu等[14]则发现T2DM患者降低的血浆miR-126可作为预测T2DM发生发展的指标。miR-661与糖尿病及其微血管并发症发生发展关系密切。β-淀粉样前体蛋白裂解酶(BACE1)在胰岛素生物合成过程中发挥重要作用，其表达缺失可导致胰岛素分泌严重不足。最新证据显示，miR-661可通过与BACE1 mRNA结合并调控其表达参与T2DM发生。同时，miR-661还被报道参与锌指转录因子介导的内皮细胞向间充质转化过程和促进细胞增殖。这些证据均提示miR-661可能与T2DM及T2DM相关的微血管并发症发生密切相关[15]，但其作为T2DMC辅助诊断和预测标志物研究尚不清楚。本研究发现在T2DM及T2DMC患者血清miR-661的表达水平显著升高，ROC曲线分析结果提示miR-661对T2DM及T2DMC患者具备一定的辅助诊断价值，同时还存在鉴别诊断潜能；同时miR-661与多种血生化指标存在相关性，进一步提示miR-661可能参与了T2DM及其微血管并发症的发生发展，是T2DMC潜在的独立危险因素，可作为T2DMC患者新的辅助诊断标志物。

研究表明，循环中miRNA可以微囊泡包裹或游离形式存在。其中，包裹于微囊泡的miRNAs能被各种细胞主动或被动分泌，并随血液循环运输至受体细胞并发挥生物学功能。miR-661在T2DM患者血清中的升高机制及存在形式仍不明确。但研究显示，包裹于微囊泡的miR-661还可促进内皮细胞粘附及功能改变[16]。基于此，我们猜测miR-661在T2DM及其微血管并发症的发展过程可能来自特定细胞的分泌或释放，并可进入血管内皮细胞促进其功能改变，对于血清miR-661的深入研究将会为T2DM并发症发生发展的分子机制提供新的方向。

但我们研究的样本量还不够大，下一步将进一步扩大研究的病例数，验证miR-661在T2DM及T2DMC患者中表达，并通过细胞、动物试验研究其作用机制，为T2DM及其T2DMC的诊治提供新思路。

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SerumlevelsofmiR-661anditsclinicalvalueintype2diabetespatientswithorwithoutmicrovascularcomplications

WANGJing,WANGCheng,WANShu-jun,LIDan-dan,ZHANGChun-ni,WANGJun-jun

(DepartmentofClinicalLaboratory,NanjingGeneralHospitalofNanjingMilitaryCommend,PLA,Nanjing210002,Jiangsu,China)

王静，1983年生，女，主管技师，大学本科，主要从事临床检验工作。

R446;R587.1

A

2017-02-16)

(本文编辑王海燕)

国家自然科学基金(81271904,81401257)；江苏省自然科学基金(BK20140730);南京总医院院课题(2017049)。

汪俊军，主任技师，教授，博士，E-mail:wangjj9202@163.com。

10.13602/j.cnki.jcls.2017.09.06