液相串联质谱法测定核桃中5种黄曲霉毒素

臧国栋，杨钦沾，陈孟君，林玉婵

（惠州市农产品质量安全监督检测中心，广东惠州516008）

液相串联质谱法测定核桃中5种黄曲霉毒素

臧国栋，杨钦沾，陈孟君，林玉婵

（惠州市农产品质量安全监督检测中心，广东惠州516008）

建立核桃中黄曲霉毒素G1、G2、B1、B2、M1的测定方法。核桃经70%甲醇溶液提取、免疫亲和柱净化后，用高效液相色谱-串联三重四极杆质谱分析法测定。黄曲霉毒素 G1、G2、B1、B2、M1在 0.5 μg/L～50 μg/L 范围内与峰面积呈良好的线性关系，r＞0.999。回收率在86.5%～98.0%之间。此方法定量准确、专属性比较强，假阳性率低，有较普遍的实用性，适合核桃中黄曲霉毒素的测定。

核桃；三重四级杆质谱；黄曲霉毒素

Abstract：To establish the determination method of Aflatoxins G1，G2，B1，B2，M1in walnut.Walnut was extracted by 70%methanol solution，purified by immunoaffinity column and analyzed by ultra high performance liquid chromatography-tandem triple quadrupole mass spectrometry.The linear relationship between the peak area of Aflatoxins G1，G2，B1，B2，M1was 0.5 μg/L-50 μg/L，r＞ 0.999.The recoveries ranged from 86.5%to 98.0%.This method was accurate，and the specificity was relatively strong，the false positive rate was low，there were more general practicality，it was suitable for the determination ofAflatoxinsin walnut.

Key words：walnut；triple quadrupole mass spectrum；Aflatoxins

黄曲霉毒素（Aflatoxins）是生长在食物及饲料中的黄曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉代谢的一组化学结构类似的产物，黄曲霉毒素具有强毒性和致癌性，其中黄曲霉毒素B1急性毒性是氰化钾的10倍，慢性中毒可诱发肝癌[1-3]。黄曲霉毒素存在于土壤、动植物、各种坚果，特别是花生和核桃中。1993年被世界卫生组织（World Health Organization，WHO）的癌症研究机构划定为一类致癌物[4]，是人类原发性肝癌的主要致病因素之一，目前大多数国家和地区都已出台相关法律，对食品和饲料中黄曲霉毒素含量进行严格控制。鉴于黄曲霉毒素对人类的健康造成的危害，世界上许多国家已建立黄曲霉毒素限量标准。因此，对各类油脂中黄曲霉毒素含量的检测不可缺少，而目前油脂中黄曲霉毒素常用检测方法包括薄层色谱法、酶联免疫化学分析法、液质联用法、微柱筛选法和高效液相色谱法。在本研究中，我们建立用高效液相色谱-串联三重四极杆质谱对核桃中的黄曲霉毒素G1、G2、B1、B2、M1进行测定。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent G6460三重串联四极杆质谱仪，配电喷雾离子源，配Agilent 1290超高效液相色谱仪：美国Agilent公司；TGL-16M高速冷冻离心机：湘仪离心机公司；SC-8L-150数控固相萃取装置：广州智真生物公司；MCX 固相萃取小柱（60 mg，3 mL）：美国 Waters公司；微孔滤膜（0.22 μm）：天津津腾公司；

黄曲霉毒素总量免疫亲和柱（3mL/60mg）：美国Beacon；黄曲霉毒素 G1、G2、B1、B2、M1标准品溶液：农业部环境保护科研监测所；黄曲霉毒素 G1、G2、B1、B2、M1的浓度均为 1.0 μg/mL；核桃：市场购买；甲醇、乙腈（均为色谱纯）：MERCK公司；试剂（均为分析纯）：中国医药（集团）上海化学试剂公司。

1.2 液相色谱条件

色谱柱：ZORBAX Eclipse PlusC18柱，2.1 mm×50 mm×1.8μm（Agilent公司）；柱温：30℃；流速：0.3 mL/min；进样量：10 μL；流动相：A为0.2%甲酸水溶液，B为乙腈；梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相条件Table 1 Mobile phase conditions

1.3 质谱条件

电离方式：电喷雾电离源（ESI），正离子模式扫描，多反应监测（multiple-reaction monitoring，MRM），离子源温度：350℃；气体：氮气；干燥气流速：6 L/min；雾化器压力：310 kPa；鞘气温度：350℃；经过对毛细管出口电压、碰撞池能量等质谱参数的优化，最终确定黄曲霉毒素 G1、G2、B1、B2、M1质谱条件见表2。

表2 黄曲霉毒素G1、G2、B1、B2、M1检测的质谱参数Table 2 Mass spectrometry parameters of Aflatoxins G1，G2，B1，B2，M1

1.4 样品预处理

准确取粉碎均质样品5.0 g加入1.0 g氯化钠和70%甲醇水溶液25 mL，均质器高速搅拌提取1 min，然后超声处理10 min，10 000 r/min离心5 min，定性滤纸过滤，吸取上清液5 mL，用水稀释至20 mL，摇匀，待净化。取10 mL待测液，缓慢通过免疫亲和柱，流速控制在1 mL/min左右，再用10 mL纯水淋洗，弃去淋洗液，准确加入1.0 mL甲醇洗脱，流速控制在1 mL/min～2mL/min，收集甲醇洗脱液，涡旋混合1 min，过0.22 μm微孔滤膜于进样瓶，供液质分析。

2 结果

2.1 线性关系

配制黄曲霉毒素（AFT）G1、G2、B1、B2、M1混合标准溶液浓度从 0.5 μg/L～50.0 μg/L，进行检测分析，结果表明：在 0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L 的浓度范围内，黄曲霉毒素 G1、G2、B1、B2、M1都具有良好的线性，线性相关系数r大于0.999，记录各待测组分色谱峰面积，以各成份的进样量为横坐标（X），各成份的峰面积为纵坐标（Y），进行回归分析，校正曲线结果见表3。

表3 回归方程和相关系数Table 3 Regression equation and correlation coefficient

2.2 检出限及定量限

以3倍信噪比（S/N=3）对应的浓度作为方法检出限（LOD），以10倍信噪比（S/N=10）对应的浓度作为方法定量限（LOQ），5种黄曲霉毒素的检出限为0.2μg/kg～0.3 μg/kg，定量限为 0.5 μg/kg～1.0 μg/kg，均满足检测要求，结果见表4。

表4 5种黄曲霉毒素检出限和定量限Table 4 LOD and LOQ about 5 kinds of Aflatoxins

2.3 回收率及精密度

在核桃阴性样品中添加3.0 μg/L及10.0 μg/L黄曲霉毒素混合标准溶液，按1.4方法进行前处理，平行测定6次，得到方法平均回收率及精密度，结果如表5所示。5种黄曲霉素的平均回收率为86.5%～98.0%，RSD为0.3%～2.9%。

2.4 样品测定结果

按拟订方法测定核桃样品，结果未检出黄曲霉毒素 G1、G2、B1、B2、M1。

表5 5种黄曲霉毒素回收率及相对标准偏差（n=6）Table 5 Recovery and relative standard deviation about 5 kinds ofAflatoxins（n=6）

3 讨论

3.1 提取剂的选择

黄曲霉毒素易溶于有机试剂甲醇和乙腈，普遍采用的提取方法是用一定比例的甲醇水[5-7]或乙腈水[8-9]来提取样品中的黄曲霉毒素，本文选用70%甲醇水溶液为提取剂。

3.2 净化小柱的选择

目前，用于黄曲霉毒素分离纯化的固相萃取方法有多功能净化柱[1]、免疫亲和柱[10-11]和分散固相萃取法（C18）[12]等，由于免疫亲和柱，本文使用免疫亲和柱净化样品。灵敏度高，用凝胶作为固相载体，与黄曲霉毒素 G1、G2、B1、B2、M1高特异性的单克隆抗体共价连接，可以有效除去杂质，相比传统净化方法，操作简单快速灵敏度高，可实现较大量样品的提取。

3.3 质谱条件的优化

在电喷雾正离子监测模式下对AFT B1、AFT B2、AFT G1、AFT G2进行一级质谱扫描，得到母离子；然后对母离子进行子离子扫描（Product Ion Scan）得到子离子；对裂解电压（Fragmentor）和碰撞能量（CE）等二级质谱参数进行优化，以由母离子产生的子离子丰度达到最大时为最优，选择两个丰度最高一对子离子作为定量和定性离子。

3.4 液相条件的优化

普遍用乙腈-水作为流动相，质谱灵敏度高，在乙腈-水中加入甲酸有助于待测物母离子 [M＋H]＋的形成，而且随着甲酸浓度的增加，质谱响应值增加，超过一定的浓度反而下降[13-14]，本文采用乙腈-水（0.2%甲酸）作为流动相。因为5种黄曲霉毒素的分子结构比较接近，采用梯度洗脱能较好的得到分离。

4 结论

目前，黄曲霉毒素 G1、G2、B1、B2、M1文献记载的测定方法有液相色谱法、薄层色谱法、酶联免疫法、荧光分光光度法等[4]，我国现在还没有黄曲霉毒素的质谱检法的国标，与以前的方法相比，本文采用免疫亲和柱净化样品，用高效液相色谱-三重四极杆串联质谱分析样品，优点在于待分析样品无需衍生，可直接分析测定，大大减少了分析的时间，结果准确性和检测灵敏度大幅度提高，此方法快速、灵敏、准确、专属性比较强，假阳性率低，有较普遍的实用性，是核桃及其其它坚果中的黄曲霉毒素测定较好的参考方法。

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Determination of Aflatoxins G1，G2，B1，B2and M1in Walnut by HPLC-MS/MS

ZANG Guo-dong，YANG Qin-zhan，CHEN Meng-jun，LIN Yu-chan
（Huizhou Center for Agricultural Products Quality and Safety Supervision and Testing，Huizhou 516008，Guangzhou，China）

2017-02-21

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.19.028

惠州市科技计划项目（2014B40008003）

臧国栋（1981—），男（汉），硕士，研究方向：抗逆分子生物学。