APP下载

黄曲霉毒素免疫亲和柱重复利用的探讨

2014-03-27赵丽元郝爱鱼刘英慧

中国现代药物应用 2014年1期
关键词:黄曲霉药典中药材

赵丽元 郝爱鱼 刘英慧

免疫亲和柱是20世纪90年代在分析领域得到应用的一种新技术,它是将一定量的单克隆抗体偶联在合适的担体上,制成相应的免疫亲和柱。该柱具有高选择性吸附和抗干扰的特性,净化效果好,检测灵敏度高,是目前国际上较为常用的检测真菌毒素样品前处理方法之一[1]。《中国药典》2010年版一部[2]、《欧洲药典》7.0[3]、GB/T 18979-2003[4]中均采用该方法进行黄曲霉毒素的测定。随着《中国药典》中收载需检测黄曲霉毒素的中药材和制剂的品种的增加,以及中药中黄曲霉毒素残留研究的深入[5-9],免疫亲和柱的使用将会越来越广泛。但从文献报道来看,免疫亲和柱的使用条件和回收处理条件研究并不是很多。仅有王莹等[1]人对M1免疫亲和柱的制备及使用条件进行了优化;李佩暖等[10]人对黄曲霉毒素前处理方法进行了优化;李卫岗等[11]人重复使用了3次无明显影响。以上文章是以牛奶和花生为样品对黄曲霉毒素免疫亲和柱前处理方法进行的研究,未见有人以中药材为样品对黄曲霉毒素免疫亲和柱的回收纯化及重复利用进行研究,本文即以中药材为样品对黄曲霉毒素免疫亲和柱的重复利用的影响因素进行研究。目前,黄曲霉毒素免疫亲和柱的生产厂家较少,美国VICAM,德国LC-Tech及北京华安麦科生物技术有限公司为较常见,价格在100~200元范围内。由于此免疫亲和柱为一次性使用,不建议重复使用,因此一份样品的检验成本就要近200元,对于一般的实验室或将进行黄曲霉素的深入研究的实验室,检验或科研成本将大大增加,从而限制了黄曲霉毒素的研究工作的开展。本文选用了使用最广泛的美国VICAM公司的AflaTest@P免疫亲和柱为研究对象,对其重复利用的影响因素进行研究。

1 仪器与试药

2695e高效液相色谱仪;光衍生器UVE(LC Tech公司);黄曲霉毒素混合对照品(Supelco公司;批号:LB82382);免疫亲和柱(AflaTest@P, 1 mL, VICAM公司)。

2 方法

2.1供试品溶液的制备 供试品溶液制备方法参考《中国药典》2010年版一部。PBS缓冲液:2.9 g Na2HPO4·12H2O+ 0.27 g KH2PO4+ 0.2 g KCl+ 8.0 g NaCl用超纯水溶解至1000 ml,调节pH值至7.4,加热煮沸,冷却待用。

2.2使用过的免疫亲和柱的处理方法 使用过的免疫亲和柱用5 ml水洗,5 mlPBS缓冲液过柱,洗后用PBS缓冲液填充柱子,室温放置1~2 h后,置2~8℃冰箱内放置过夜。

2.4色谱条件 用Zobax SB-C18色谱柱,以乙腈-甲醇-水为流动相,梯度洗脱。

3 结果

3.1无基质干扰时亲和柱重复利用情况 取黄曲霉毒素对照品33 ng(黄曲霉毒素B112.5 ng),用水稀释成甲醇浓度14%的溶液作为样品溶液,进行回收试验,重复使用4次,结果见表1。

表1 无基质干扰时亲和柱回收试验结果

由表1 可见,亲和柱经过四次试验,回收率的结果无明显差异,仍在90%以上,由此可见,在药材干扰的情况下,亲和柱可重复使用4次。

3.2不同中药材使用后亲和柱重复利用情况

3.2.1阴性与阳性中药材使用后亲和柱重复利用情况 取泽泻(阴性样品)和泽泻+33 ng黄曲霉毒素(阳性样品)进行考察,结果见表2和3。第一次:制备阴性中药材和阳性中药材使用一次后的亲和柱;第二次:均加入泽泻+33 ng黄曲霉毒素考察回收率;第三次:均加入泽泻+33 ng黄曲霉毒素考察回收率。

表2 阴性样品回收试验结果

表3 阳性样品回收试验结果

由表2和表3可见,亲和柱经过三次试验,无论是阴性样品柱还是阳性样品柱,回收率的结果无明显差异,黄曲霉毒素总量第二次使用后回收率为82.4%和79.2%,第三次使用后回收率为64.0%,63.9%,因此中药材中是否含有黄曲酶毒素不是影响亲和柱回收利用的主要因素。从结果可见,黄曲霉毒素的回收率随着使用次数的增加在逐渐降低,特别是G2回收率降低明显,第二次使用后回收率降低至16.2%和22.5%,第三次使用后回收率降低至3.7%,4.1%。分析原因可能是泽泻中某些物质对亲和柱中抗体造成破坏或抑制其结合,因此作者进行不同的中药材亲和柱重复利用的考察。

3.2.2种子类中药材亲和柱重复利用情况 选取容易产生黄曲霉毒素的种子类中药材杏仁,薏苡仁和柏子仁进行亲和柱的回收情况的考察,每份样品中同时加入33 ng黄曲霉毒素对照品进行回收,结果见表4。

表4 种子类中药材回收考察结果

由表4可见,亲和柱经过三次试验,杏仁和薏苡仁的回收率无明显降低,黄曲霉毒素总量以及G1,B2,B1均在90%以上,G2略有降低,但也在65%以上。柏子仁黄曲霉毒素总量以及G1,B2,B1能达到85%以上,但G2降低较大,仅达49%。从结果可见,种子类中药材也存在一定的差异,黄曲霉毒素总量以及G1,B2,B1随着使用次数的增加回收率影响不大,可以重复使用。而部分品种对G2的影响较大,不易重复利用。

3.2.3根茎类(含生物碱等活性成分)中药材亲和柱重复利用情况 选取根茎类(含生物碱等活性成分)中药材苦参,三七,玄参进行亲和柱重复利用情况的考察,每份样品中同时加入33 ng黄曲霉毒素对照品进行回收,结果见表5。

3.3亲和柱处理方法对重复利用的影响 取黄曲霉毒素对照品33 ng进行研究。免疫亲和柱加入对照品33 ng净化后:①立即用水-PBS洗涤,过夜放置;②用水-PBS洗涤后立即使用(考察复性时间的影响);③空气中暴露3 h后,水-PBS洗涤,过夜放置(考察空气暴露的影响);④甲醇中浸泡3 h后,水-PBS洗涤,过夜放置(考察有机溶剂的影响);再加入对照品33 ng过柱净化,回收结果见表6。

表5 根茎类(含生物碱等活性成分)中药材回收考察结果

由表5可见,亲和柱经过三次试验,苦参,三七,玄参黄曲霉毒素总量及各组分回收率均有降低,其中降低最明显的G2分别降低至33%,23%,50%,其次B2降低至67%,74%,83%,B1、G1和总量降低较少,回收率可达70%以上。由此可见,根茎类(含生物碱类活性成分)中药材中可能存在某些物质使亲和柱上的抗体脱落或抑制其结合,从而使回收率降低较多,不建议重复利用。

表6 亲和柱不同的处理方法对重复利用的影响

由表6可见,亲和柱使用后立即重复使用,抗体没有复性的时间,G2回收率下降了95.6%,总回收率下降了33.7%;抗体在空气中暴露至3 h,G2回收率下降了78.5 %,总回收率下降了24.9%;甲醇可以使抗体变性,当时间长时,可以造成不可逆转的损害,当甲醇中时间长达3 h,G2回收率下降93.2%,总回收率下降了16.6%。

4 讨论

4.1黄曲酶毒素免疫亲和柱的净化受很多因素的影响,Siu-Po等人考察了较低pH值[9]对免疫亲和柱的回收有很大的影响,很多在提取液中pH值较低(pH 4以下)的中药材其回收率均较低,特别对黄曲霉素G2的影响更大,因此通过在稀释溶液中加入0.1 mol·L-1磷酸盐缓冲液可提高其回收率。在对中药材进行回收率的考察时,作者对样品的提取液同时进行了pH值的测定,结果均在6~8之间,因此排除了pH值低对回收率的影响。

4.2免疫亲和柱上偶联的抗体属于蛋白质类,在某些条件比如有机溶剂,失去缓冲条件等条件下可能变性失活。因此免疫亲和柱使用后,应立即用水或PBS洗涤,尽可能缩短空气中暴露的时间,并需要4℃放置使抗体充分复性。

4.3在研究时作者采用了黄曲霉毒素对照品33 ng(黄曲霉毒素B112.5 ng)进行的回收考察,其浓度比样品进行三水平回收率最高浓度略高,其目的是考察柱子在进行回收率考察后是否可以重复利用。

通过对照品无基质条件下的考察,在柱容量范围内,亲和柱的重复利用不会对回收率有显著影响,而样品中是否含有黄曲酶毒素也不会显著影响样品的回收率。在对3种种子类中药材(杏仁,薏苡仁,柏子仁)进行考察时,除柏子仁中G2降低明显外,其余回收率均无明显降低,因此亲和柱可以重复利用,这与李佩暖等[10]人以花生为样品进行亲和柱的重复利用考察结果基本一致。在对4种根茎类中药材(泽泻,苦参,三七,玄参)的考察时,回收率均降低较多,而G2更是最容易受影响部分,因此亲和柱不利于重复利用,这可能与根茎类中药材复杂的化学成分(如生物碱,黄酮,皂苷等活性物质)有关,从而使抗体脱落或抑制抗体结合,最终原因有待深入研究。

4.4本研究为中药材检测中黄曲酶毒素免疫亲和柱的重复利用研究建立一种方法,对于不同品种使用后的亲和柱是否可重复利用需要具体考察,如回收率无明显降低,即可以重复利用,从而大大降低试验成本。

[1] 王莹,柳家鹏.黄曲霉毒素M1免疫亲和柱的制备及使用条件优化.中国奶牛,2011,1: 44.

[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典一部.北京:中国医药科技出版社,2010附录IX V, 61.

[3] 欧洲药典委员会.欧洲药典.欧洲药品质量管理局,2010.

[4] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.食品中黄曲霉毒素的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法,2003:89.

[5] 冯旭,孔维军,杨美华.中药中真菌毒素检测方法的最新研究进展.世界科学技术-中医药现代化,2012(5):1944.

[6] 王少敏,许勇,毛丹,等.HPLC-MS/MS法测定中药桃仁中黄曲酶毒素G2,G1,B2,B1.药物分析杂志,2011,31(5):907.

[7] 郝爱鱼,赵丽元,刘英慧,等. HPLC柱后光衍生荧光法测定中药饮片中黄曲酶毒素残留量.药物分析杂志,2012,32(12):2203.

[8] 韦日伟,杨小丽,仇峰,等.免疫亲和柱净化-在线柱后光化学衍生-HPLC-FLD同时测定甘草中黄曲酶毒素B1,B2,G1,G2和赭曲霉毒素A的含量.现代中药杂志, 2011,36(17):2342.

[9] SIU-Po Ip,CHUN-Tao Che. Determination of aflatoxins in Chinese medicinal herbs by high-performance liquid chromatography using immunoaffinity column cleanup: Improvement of recovery.J of Chromatography A, 2006,1135(2):241.

[10] 李佩暖,曹鹏,耿金培,等.黄曲霉毒素前处理方法的研究-免疫亲和柱的重复利用.检验检疫学刊, 2009,19(5):21.

[11] 李卫岗,鲁长豪.黄曲霉毒素B1免疫亲和柱的制备研究.中国公共卫生学报,1992,11(6): 361.

猜你喜欢

黄曲霉药典中药材
夏季中药材田间管理做好这五点
中药材促农增收
河滩地建起中药材示范区
黄曲霉侵染茶树籽产黄曲霉毒素的研究
牛奶中黄曲霉毒素的危害及常用检测方法
宋四清:种植中药材 托起致富梦
孜然精油对产毒黄曲霉的抑制活性研究
《中国药典》收载民族药成方制剂的统计与分析
我国与国外药典中苯扎氯铵的质量控制标准及相关方法比较
66种中药材进入欧洲药典 未来目标达到300种