肝素亲和柱在乳铁蛋白检测中的应用优化

楼飞，杨秀敏，章寅

（1.上海市农业科学院庄行综合试验站，上海201415；2.沈阳市动物疫病预防控制中心，辽宁沈阳110034；3.上海德诺产品检测有限公司，上海200436）

乳铁蛋白是近年来国内外开发研究速度较快的一种营养添加剂，由于其具有：广谱抗菌，抗病毒感染作用；能调节体内铁平衡；调解骨髓细胞的生成；抑制人体肿瘤细胞的作用；能同多种抗生素及抗真菌制剂协同作用，有效地治疗疾病等功效，使其产品在国内外食品加工中的应用范围日益广泛[1-2]。乳铁蛋白是一种极具营养价值的活性糖蛋白，对婴幼儿或者成人的健康具有重要的意义[3-4]。GB14880-2012我国《食品营养强化剂使用标准》中规定婴幼儿配方食品中乳铁蛋白的最大允许使用量为1.0 g/kg，而目前国内外未建立乳铁蛋白测定相关的国家标准。文献中报道的测定乳铁蛋白含量的方法大致可以归为以下几类：酶联免疫吸附法、十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、毛细管电泳法、高效液相色谱法和高效液相串联质谱法[5-7]。

其中，酶联免疫吸附法是将抗原、抗体特异性反应和酶的高效催化作用有机结合起来的一种新颖、快速的免疫学分析技术，具有灵敏度高、检测限低、样品无需纯化等特点，因此该法应用范围最广、常用于包括初乳和乳粉等一系列产品中的乳铁蛋白质量浓度的测定，但该法所用试剂盒昂贵，不适于长期大量检测乳铁蛋白。SDS-PAGE法具有测定准确快速、操作简便等特点，适用于初步分离效果的监控，但对纯度较低的乳铁蛋白检测时，由于乳铁蛋白与其他杂蛋白分子量相近，很难达到分离，故仅适用于高纯度的样品测定。毛细管电泳法由于进样量少，因而制备能力差，而且由于毛细管直径比较小，造成了灵敏度较低，重现性差等一系列缺点。

高效液相色谱法拥有分离效率高，选择性好，检测灵敏度高，操作自动化等优点，是目前食品检测领域应用最广泛的方法之一。乳铁蛋白的等电点为8.2左右，是一种分子量为80 kDa，具有大约700个氨基酸残基序列的单体糖蛋白，并连接1～2个配糖体（配糖体成分约占7%）[8-10]。乳铁蛋白一共有两个铁离子结合位，每个结合位可以与一个铁离子结合。现已有多篇文献研究报道应用高效液相色谱检测乳制品中的乳铁蛋白含量，前处理方法包括：（1）样品采用脱脂，酸法去除酪蛋白，硫酸铵沉淀富集，纤维素滤膜过滤净化等方法进行预处理[11-12]；（2）通过额外加入的二价铁离子使乳铁蛋白的构型更利于沉淀，然后用体积分数60%乙醇溶液沉淀蛋白除去糖分，再用醋酸盐缓冲液提取乳铁蛋白并分离掉酪蛋白进行预处理[13-14]；（3）样品采用0.5 mol/L氯化钠溶液溶解，稀释至适当浓度作为预处理等方法[15]。

肝素是一种含硫酸酯的酸性多糖，有文献报道乳铁蛋白可与这类多负电荷分子糖胺多糖通过亲和层析结合[16-18]。本标准中采用HiTrapTMHeparin HP（1 mL）肝素亲和柱作为目标化合物纯化和浓缩的前处理步骤[19-20]，由于是首次将该亲和柱应用到乳铁蛋白的检测中，故对应用条件进行了摸索和优化，包括：肝素亲和柱的承载量、淋洗液和洗脱液的浓度、pH值等参数的优化等，建立一种适合乳铁蛋白检测的前处理净化方法。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

乳铁蛋白标准物质（批号：SP113101）：Tatua公司提供；乙腈为（色谱纯）：美国默克公司；无水乙醇、氯化钠、磷酸、磷酸氢二钠、三氟乙酸（均为分析级）：国药集团化学试剂有限公司产品；超纯水：美国赛默飞世尔科技有限公司；高效液相色谱仪：美国安捷伦科技有限公司；HiTrapTMHeparin HP（1 mL）肝素亲和柱：美国通用电气医疗集团；Jouan Ceterifuge MR23i离心机：美国赛默飞世尔科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 肝素亲和柱的应用比较

本方法中采用HiTrapTMHeparin HP（1 mL）肝素亲和柱作为目标化合物纯化和浓缩的前处理步骤。通过经过和未经过肝素亲和柱纯化的样品色谱图，分析其对乳铁蛋白检测应用的可行性。

1.2.2 肝素亲和柱承载量的测定

该款肝素亲和柱对乳铁蛋白纯化和浓缩的前处理步骤未有报道，亲和柱的承载量对方法的准确度方面有很大的影响，故在本方法中进行了承载量的试验。采用40 μg～10 000 μg不同的上柱量测定回收率的方式，选定承载量范围值。

1.2.3 磷酸盐浓度的优化

前处理过程中需要分离纯化乳铁蛋白，故首先要求将乳铁蛋白从基质中以溶解的状态释放出来，并保持原先的天然状态，不丢失生物活性。故在本方法中进行磷酸盐浓度的优化，通过奶粉本底和加标回收率的测定，在磷酸盐pH=7.0的条件下，依次选择浓度为0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mol/L 进行比较。

1.2.4 磷酸盐pH值的优化

乳铁蛋白是一种分子量为80 kDa，具有大约700个氨基酸残基序列的单体糖蛋白，并连接1个～2个配糖体。对于这一类大分子量的蛋白质，pH值对其的结构有一定的影响。故在本方法中进行磷酸盐pH值的优化，通过奶粉本底和加标回收率的测定，在磷酸盐浓度为0.2 mol/L的条件下，依次选择pH值为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 进行比较。

1.2.5 洗脱液盐浓度的优化

洗脱步骤属于肝素亲和柱使用过程中比较关键的步骤，在此步骤中乳铁蛋白目标化合物将从亲和柱中被洗脱下来，故洗脱液的浓度对整个试验比较关键。选定Na2HPO4的浓度为0.05 mol/L，pH=7.0，设定4个不同浓度的 NaCl浓度即 0.25、0.50、1.0、2.0 mol/L，通过加标回收测定，选定最佳的NaCl浓度。

1.2.6 洗脱液pH值的优化

同样原理，选定0.05 mol/L的Na2HPO4，1.0 mol/L浓度的NaCl，设定5个不同的pH值即5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，通过加标回收测定，选定最佳的pH值。

1.2.7 肝素亲和柱洗脱体积的测定

本方法中采用1 mL规格的HiTrapTMHeparin HP亲和柱，乳铁蛋白的上柱量控制在 100 μg～10 000 μg，试验设计当乳铁蛋白的上柱量为最大值即10 000 μg时，分别收集第 1 mL，第 2 mL，第 3 mL，第 4 mL，第5 mL，第6 mL～8 mL的洗脱液，上机测定。

1.2.8 自制肝素亲和柱性能的比较

目前市场上使用率最高的肝素亲和柱是由美国通用电气医疗集团生产的HiTrapTMHeparin HP亲和柱，为了验证乳铁蛋白检测是否只能依靠该款亲和柱，本试验采用偶联有肝素分子的琼脂糖作为填料自制了一批肝素亲和柱。将自制的肝素亲和柱与Hi-TrapTMHeparin HP肝素亲和柱在相同的试验条件下进行回收率的测定。

1.3 液相色谱条件

色谱柱规格：C4，5 μm，300A°（孔径），250 mm×4.6 mm（内径）；检测波长：280 nm；柱温：30℃；进样体积：50 μL；流速：1.0 mL/min；流动相：0.1%三氟乙酸溶液和乙腈，梯度洗脱参数见表1。

表1 流动相梯度洗脱程序表Table 1 Optimization of gradient elution

2 结果与分析

2.1 肝素亲和柱的应用比较

图1为经过和未经过肝素亲和柱纯化的样品液相色谱比较图。

图1 肝素亲和柱纯化样品比较色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of lactoferrin with heparin affinity column cleanup and without

从色谱图1中可以看出未纯化的样品成分复杂，难以满足检测需要，经过肝素亲和柱纯化的样品，杂质少，峰形好，符合检测的要求。

2.2 肝素亲和柱承载量的测定

1 mL HiTrapTMHeparin HP肝素亲和柱对乳铁蛋白承载量的测定结果见表2。

表2 1 mL HiTrapTMHeparin HP肝素亲和柱对乳铁蛋白承载量的测定（n=3）Table 2 Determination of the bearing capacity of lactoferrin by 1 mL HiTrapTMHeparin HP（n=3）

从表2可知，当乳铁蛋白的上柱量达到100 μg时，1 mL规格的HiTrapTMHeparin HP肝素亲和柱的回收率就达到90%以上，乳铁蛋白的上柱量在100 μg～10 000 μg时，回收率在 93.8%～105%之间，符合试验要求。故本试验中将样品中乳铁蛋白的上柱量控制100 μg～10 000 μg之间，如果试验中遇到高浓度乳铁蛋白含量的样品时，需将样品稀释至合适的浓度后再使用亲和柱；反之则可适当增加称样量和上柱体积。

2.3 磷酸盐浓度的优化

磷酸盐浓度的优化结果见表3。

表3 磷酸缓冲液浓度优化表（n=3）Table 3 Optimization of phosphate buffer concentration（n=3）

从表3数据得知，随着磷酸缓冲液浓度的增加，回收率先增加后降低至零，当磷酸缓冲液浓度达到0.4 mol/L时，回收率为0，故选定乳铁蛋白检测时磷酸缓冲液浓度为0.2 mol/L，同时发现在该浓度下目标峰附近的杂质最少，符合试验要求。

2.4 磷酸盐pH值的优化

磷酸盐pH值的优化结果见表4。

表4 磷酸缓冲液pH优化表（n=3）Table 4 Optimization of phosphate buffer pH（n=3）

从表4可知，随着磷酸缓冲液pH值的增加，回收率先增加后降低，整体数值在72.3%～91.3%之间，当磷酸缓冲液pH值为8.0时回收率为最大，同时此pH值下目标峰附近的杂质最少，符合试验要求。

2.5 洗脱液盐浓度的优化

洗脱液盐浓度的优化结果见表5。

从表5可知，随着NaCl浓度的增加，回收率相应增加。高浓度的NaCl有利于乳铁蛋白从亲和柱中的洗脱。但2.0 mol/L的NaCl容易造成液相色谱仪的损伤，不利于机器稳定状态的保持，故选定1.0 mol/L的NaCl作为洗脱浓度。

表5 洗脱液盐浓度优化表（n=3）Table 5 Optimization of NaCl concentration（n=3）

2.6 洗脱液pH值的优化

洗脱液pH值的优化结果见表6。

表6 磷酸缓冲液pH优化表（n=3）Table 6 Optimization of phosphate buffer pH（n=3）

从表6试验结果可以得知，不同的pH值下，回收率范围为94.9%～98.0%，最高值和最低值的相对相差3.2%，故选定常规的pH=8。

2.7 肝素亲和柱洗脱体积的测定

肝素亲和柱洗脱体积的测定结果见表7。

表7 肝素亲和柱洗脱体积的测定（n=3）Table 7 Optimization of elution volume（n=3）

由表7可知1 mL规格的HiTrapTMHeparin HP肝素亲和柱，乳铁蛋白的上柱量为10 000 μg时，收集到的第1 mL和第2 mL的洗脱液中乳铁蛋白总的洗脱率达到96.5%以上，第3 mL洗脱液中乳铁蛋白的洗脱率为 0.15%，第 4 mL，第 5 mL，第 6 mL～8 mL的洗脱液中未检测到乳铁蛋白，故本试验中选定收集洗脱液的体积为3.0 mL。

2.8 自制肝素亲和柱性能的比较

自制肝素亲和柱性能的比较结果见表8。

表8 自制肝素亲和柱性能的比较（n=3）Table 8 Comparison of the properties of homemade heparin affinity columns（n=3）

由表8可知，在相同的试验条件下上海德诺产品检测有限公司的实验室自制的亲和柱平均回收率为97.6%，相对相差1.4%，HiTrapTMHeparin HP肝素亲和柱的平均回收率100.4%，相对相差1.9%，柱效比较接近，证明同类型的肝素亲和柱可以使用到本方法中用于乳铁蛋白的检测。

3 结论

本文首次提出将肝素亲和柱应用到乳铁蛋白检测前处理过程中，优化之后的前处理过程包括：试样中的乳铁蛋白经磷酸氢二钠溶液（0.20 mol/L，pH=8.00±0.5）提取，HiTrapTMHeparin HP 1 mL 规格的亲和柱经上述磷酸氢二钠溶液活化后，上样，经过磷酸氢二钠溶液淋洗，磷酸氢二钠-氯化钠溶液（磷酸氢二钠0.05 mol/L，NaCl 1 mol/L，pH=8.00±0.5）洗脱，并定容至3.0 mL，上机测定。本方法与文献中报道的方法相比，具有检测成本低、操作方便简单、耗时较短、重复性好、灵敏度高的优势，能满足目前乳铁蛋白的日常检测任务。