3种大肠埃希氏菌O157：H7筛检方法的比较

张婧，王利刚，张磊，费云滟，付莎莉，吴丹，陈欣，杨小珊

（重庆市食品药品检验检测研究院，重庆401121）

3种大肠埃希氏菌O157：H7筛检方法的比较

张婧，王利刚，张磊，费云滟，付莎莉，吴丹，陈欣，杨小珊*

（重庆市食品药品检验检测研究院，重庆401121）

比较mini-VIDAS、膜芯片两种快速筛检方法和常规培养法，以确定两种快速筛检方法对大肠埃希氏菌O157：H7筛检的效果。以大肠埃希氏菌O157：H7为目标菌，针对3种方法设计灵敏性、特异性、抗干扰性试验和人工污染试验。结果表明，常规培养法和mini-VIDAS法的灵敏性较高，mini-VIDAS法和膜芯片法的特异性和抗干扰性较高，人工污染试验三者表现符合预期。日常检验中可采用国标法和mini-VIDAS法进行筛检工作，应急检验可使用膜芯片法缩短筛检时间，mini-VIDAS法和膜芯片法可作为初步筛检的工具使用。

大肠埃希氏菌O157：H7；mini-VIDAS；膜芯片；筛检

Abstract：This study aimed to compare of two rapid pre-detection methods and traditional culture method for detection ofEscherichia coliO157：H7.Experiments were designed to test the sensitivity，specificity and anti interference of these methods，artificially contaminated samples were tested and verified.The results showed that，traditional culture method and mini-VIDAS method with high sensitivity，mini-VIDAS and membranebased array method with specificity and high anti-interference，artificially contaminate test was as expected.Traditional culture method and mini-VIDAS method can be used for pre-detection in daily inspections，membrane-based array method could shorten the pre-detection time in emergency testing.Additionally，mini-VIDAS and membrane-based array are good tools for pre-detection of theEscherichia coliO157：H7.

Key words：Escherichia coliO157：H7；mini-VIDAS；membrane-based array；pre-detection

大肠埃希氏菌 O157：H7（Escherichia coliO157：H7，E.coliO157）是一种食源性致病菌，是肠出血性大肠埃希氏菌的主要血清型，感染后会出现腹泻、出血性肠炎等症状，进而引发溶血性尿毒综合征、血栓形成性血小板减少性紫癜等严重并发症，两种并发症的致死率高达30%[1-2]。1982年美国爆发了由E.coliO157导致的流行感染，之后世界各国相继发生，美国、加拿大、日本等国发病案例较多，1997年，世界卫生组织将E.coliO157列为新的食源性致病菌[3-4]。我国E.coliO157流行多为散发案例，但在江苏、安徽、河南等地出现过流行爆发的报道[5-7]。为控制食品中E.coliO157污染，预防E.coliO157导致食源性疾病发生，国家卫生计生委对其在食品中的限量进行了规定[8]。

E.coliO157的常规检验方法为培养法[9]，操作步骤繁琐，人员素质要求高，且耗时较长，已经不能满足现在食品检测中高通量、短时效的要求。随着检验技术的进步，基于分子技术、免疫学技术的快速筛检方法[10-13]逐步进入检验行业，可靠稳定的技术被开发为商业化的产品。本试验将VIDAS大肠杆菌O157（ECO）筛选法[14]和膜芯片法两种快速筛检方法与常规培养法进行对比，从灵敏性、特异性、抗干扰性等方面进行试验，评估两种快速筛检方法在检验工作中的可操作性。

1 试验材料

1.1 菌株与样品

大肠埃希氏菌 O157：H7（Escherichia coliO157：H7，CICC 21530）、福氏志贺氏菌（Shigella flexneri，CICC 10865）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，CICC 21636/ATCCR27853TM）：中国工业微生物菌种保藏管理中心；大肠埃希氏菌（Escherichia coli，ATCCR25922TM）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica subsp.enterica serovar Typhimurium，ATCCR14028TM）、单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes，ATCCR19115TM）：美国菌种保藏中心。

样品为实验室日常检验样品。

1.2 主要仪器

ZDP-2106常规生化培养箱：上海智城分析仪器制造有限公司；mini-VIDAS全自动免疫分析仪：法国生物梅里埃股份有限公司；MFS-8膜芯片杂交仪、IMG-1膜芯片成像仪：四川华汉三创生物科技有限公司。

1.3 主要试剂

常规培养基、大肠杆菌O157显色培养基：北京陆桥技术股份有限公司；VIDAS大肠杆菌O157（ECO）试剂条：法国生物梅里埃股份有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒：天根生化科技有限公司；致病微生物检测芯片：四川华汉三创生物科技有限公司。

2 方法

2.1 3种方法操作步骤

2.1.1 常规培养法

按照GB/T 4789.36-2008《食品卫生微生物学检验大肠埃希氏菌O157：H7/NM检验》第一法检验流程，转接大肠杆菌O157显色培养基，36℃培养24 h，观察筛检结果。

2.1.2 mini-VIDAS法

按照GB/T 4789.36-2008《食品卫生微生物学检验大肠埃希氏菌O157：H7/NM检验》第三法检验流程，培养后上机检验，检验结束后仪器报告并打印筛检结果。

2.1.3 膜芯片法

接种产品自带培养基，并按照其要求培养温度、时间培养后，使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌总DNA，使用自带的PCRMix对提取的DNA进行扩增，扩增产物99℃变性10 min，膜芯片杂交仪进行杂交、洗脱等操作，结束后使用膜芯片成像仪观察筛检结果。

2.2 灵敏性试验

标准菌株大肠埃希氏菌O157：H7接种到改良EC肉汤培养基中，36℃培养24 h，按照1∶10进行梯度稀释，获得103CFU/mL～106CFU/mL浓度的菌悬液，不同浓度视作不同方法液体培养基培养物，并分别采用2.1.1、2.1.2、2.1.3 的方法进行筛检。

2.3 特异性试验

大肠埃希氏菌O157：H7、福氏志贺氏菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌分别进行培养，培养物按照1∶10进行梯度稀释，获得105CFU/mL浓度的菌悬液，分别采用2.1.1、2.1.2、2.1.3 的方法进行筛检。

2.4 杂菌干扰试验

大肠埃希氏菌O157：H7、福氏志贺氏菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌分别进行培养，按照1∶10进行梯度稀释，以大肠埃希氏菌O157：H7为目标，设定3组混合菌。第一组福氏志贺氏菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌的浓度为 103CFU/mL，按照体积比 1∶1∶1∶1∶1混合，第二组5种菌的浓度为104CFU/mL，按照体积比1∶1∶1∶1∶1混合，第三组5种菌的浓度为105CFU/mL，按照体积比1∶1∶1∶1∶1混合。以上混合菌按照体积比1∶1的比例与浓度105CFU/mL大肠埃希氏菌O157：H7混合，同时分别使用浓度105CFU/mL大肠埃希氏菌O157：H7和浓度105CFU/mL混合菌作为阳性和阴性对照，分别采用2.1.1、2.1.2、2.1.3的方法进行筛检。

2.5 人工污染试验

收集实验室检验的大肠埃希氏菌O157：H7阴性样品20批次，其中畜肉制品5批次、禽肉制品5批次、动物内脏制品5批次、蔬菜制品5批次，每批次样品分为两组，一组为阳性组，按照每25g样品添加1mL浓度103CFU/mL大肠埃希氏菌O157：H7的比例进行人工污染，一组为阴性对照组，不进行人工污染，分别采用2.1.1、2.1.2、2.1.3的方法进行筛检。

3 结果与讨论

3.1 灵敏性试验结果

用3种方法对不同浓度的大肠埃希氏菌O157：H7菌悬液进行灵敏性试验的结果如表1所示，在常规培养法中，显色培养基上出现典型菌落的浓度为104CFU/mL，mini-VIDAS法判定阳性的浓度为104CFU/mL，膜芯片法检出浓度为105CFU/mL，mini-VIDAS法灵敏性高于其他两者。在常规培养法中采用的显色培养基选择性强，因此对灵敏性有一定影响，在显色培养基上的生长状态符合其典型菌落特征。mini-VIDAS法基于抗原抗体反应，灵敏性较高，当检测阈值（TV，test va lue）值大于0.10时，系统判定检出大肠埃希氏菌O157：H7。膜芯片法通过核酸杂交显色后观察是否阳性，但在杂交前还经过了DNA提取、PCR扩增、高温变性等过程，操作步骤越多对灵敏度的影响越大。

表1 不同检测方法灵敏性比较Table 1 Comparison of sensitivity of three methods

3.2 特异性试验结果

常规培养法中，显色培养基上大肠埃希氏菌O157：H7的生长特征明显，同菌属的大肠埃希氏菌也可以有效分离，但是福氏志贺氏菌与大肠埃希氏菌O157：H7生长情况相似，还需进行下一步试验才能确定。基于抗原抗体特异结合反应的mini-VIDAS法对大肠埃希氏菌O157：H7的特异性较强，除单核细胞增生李斯特氏菌判定阳性外，其他几种菌的判定均为阴性。膜芯片法针对大肠埃希氏菌O157：H7的eaeA基因设计探针，特异性较好。不同检测方法特异性比较见表2。

表2 不同检测方法特异性比较Table 2 Comparison of specificity of three methods

3.3 杂菌干扰试验结果

按照2.4的设计，干扰菌的总浓度水平为104、105、106CFU/mL，分别处于高于、相当、低于大肠埃希氏菌O157：H7的浓度水平，阳性对照和阴性对照的结果显示3种方法的操作正常。常规培养法中在3个设计中均有典型菌落生长，但由于其中有其他干扰菌的存在，故无法直接判定，还需进一步试验才能确定，同时由于杂菌存在，进行鉴定时应该选择多个菌落进行鉴定，以防发生漏检的情况。Mini-VIDAS法的筛检结果均为阳性，阴性对照结果为阴性，显示了该方法的特异性较强。膜芯片法在干扰菌浓度低或者相当时检出，干扰菌浓度高时未检出的原因分析为，DNA提取后总DNA浓度不变，但是目标菌的DNA浓度相对降低，影响判定结果。不同检测方法抗干扰性比较见表3。

表3 不同检测方法抗干扰性比较Table 3 Comparison of anti-interference of three methods

3.4 人工污染试验

人工污染试验中，常规培养法对于阳性组的筛检效率为100%，仍需进行下一步试验；对阴性组的筛检效率为5%，其中有1批次牛肉有典型菌落，进一步试验后确定非肠埃希氏菌O157：H7。mini-VIDAS法对于阳性组筛检效率为100%，对阴性组筛检效率为0%，完全符合人工污染设计。膜芯片法对于阳性组筛检效率为100%，但是阳性结果观察显色程度不同，个别显色较浅，肉眼几乎无法分辨，借助膜芯片成像仪可见显色，分析原因为增菌过程中由于杂菌较多大肠埃希氏菌O157：H7未形成优势菌株，进而影响以后的一系列操作，符合预期。人工污染试验筛检结果比较见表4。

表4 人工污染试验筛检结果比较Table 4 Comparison of the screening for artificially contaminated samples

4 结论

从两种快速筛检方法与常规培养法的比较结果可以看出，常规培养法的灵敏性较优，但是某些细菌在显色培养基上的生长状态与目标菌相似，使其特异性和抗干扰性受到一定影响；mini-VIDAS法在特异性、灵敏性和抗干扰上表现良好，可作为较好的筛选方法应用到检验工作中；膜芯片法的特异性较好，但是该方法要从菌株水平转换到分子水平，操作人员的熟练程度对其灵敏性有一定的影响。实际操作中3种方法的筛检时间差异较大，常规培养法为78 h，mini-VIDAS法为30 h，膜芯片法为14 h。综合以上情况，建议日常检验中可以采用国标法和mini-VIDAS法进行筛检工作，对于应急任务可使用膜芯片法缩短筛检时间，同时用mini-VIDAS法进行验证，确保试验结果的准确。

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Comparison of Three Pre-detection Methods for Detection of Escherichia coli O157：H7

ZHANG Jing，WANG Li-gang，ZHANG Lei，FEI Yun-yan，FU Sha-li，WU Dan，CHEN Xin，YANG Xiao-shan*
（Chongqing Institute for Food and Drug Control，Chongqing 401121，China）

2017-01-16

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.19.024

重庆市社会民生科技创新专项项目（cstc2015shmszx 00002）；重庆市科技计划项目（cstc2015jcsf8001）

张婧（1985—），女（汉），工程师，硕士研究生，研究方向：食源性致病菌检验。

*通信作者：杨小珊（1975—），女（汉），高级工程师，博士，研究方向：食品安全与监管。