石榴酒体外及斑马鱼体内抗氧化活性研究

张洪亚，王振国，刘邦刚，楚杰，刘可春，杨桂文

（1.山东师范大学生命科学学院，山东济南250014；2.山东省科学院生物研究所山东省生物检测技术工程实验室/山东省生物传感器重点实验室/山东省科学院药物筛选技术重点实验室，山东济南250014；3.济南大学山东省医学科学院医学与生命科学学院，山东济南250002）

石榴酒体外及斑马鱼体内抗氧化活性研究

张洪亚1，2，王振国3，刘邦刚3，楚杰2，*，刘可春2，杨桂文1，*

（1.山东师范大学生命科学学院，山东济南250014；2.山东省科学院生物研究所山东省生物检测技术工程实验室/山东省生物传感器重点实验室/山东省科学院药物筛选技术重点实验室，山东济南250014；3.济南大学山东省医学科学院医学与生命科学学院，山东济南250002）

探对石榴酒的抗氧化活性进行研究，采用分光光度法测定石榴酒对DPPH·、·OH和O2-自由基的清除能力和石榴酒的还原力，并利用皮肤荧光斑马鱼进行石榴酒的抗氧化活性试验。结果表明：石榴酒在一定范围加入量内对DPPH·、·OH和O2-有良好的清除作用，清除率最大分别为92.95%、82.76%和63.85%。在对皮肤荧光斑马鱼进行石榴酒的抗氧化活性体内试验中，石榴酒浓度在30、40、50μL/mL时，相对抗氧化能力分别达到了39.7%、60.3%、75.4%。

石榴酒；抗氧化活性；自由基；斑马鱼

Abstract：The study was to investigate the antioxidant activity of pomegranate wine.The antioxidant activity of the pomegranate wine was evaluated by spectrophotometry on its ability of scavenging 1-diphenyl-2-picrylhydrazy（DPPH·），hydroxyl radical（·OH），superoxide anion radical（O2-·）and total reducing power.The zebrafish with fluorescent skin was used to test the antioxidant activities of the pomegranate wine in vivo.The results showed that pomegranate wine had a well scavenging activity on DPPH·，·OH and O2-·in a certain range，and the highest scavenging activity were 92.95%，82.76%and 63.85%，respectively.In vivo experiment in zebrafish with fluorescent skin showed that the highest scavenging activity of pomegranate wine were 39.7%，60.3%and 75.4%in a certain concentration range（30，40，50 μL/mL）.

Key words：pomegranate wine；antioxidantactivity；free radical；zebrafish

石榴素有“九洲奇果”之美誉，果实富含多种氨基酸、碳水化合物、维生素和人体所必需的微量元素如铁、铜、锌等[1]。石榴果除鲜食外，还可加工成石榴果汁，果醋和果酒等多种产品[2-3]。石榴酒系采用石榴为主要原料，经破碎，发酵，分离，陈酿调配而成的果酒。石榴果酒中含大量多酚、类黄酮及花青素等高效抗氧化活性物质，同时含有大量的维生素C，有很强的抗氧化能力。其中，石榴酒中类黄酮的含量大大超过红葡萄酒[4]，类黄酮可中和人体内诱发疾病与衰老的氧自由基，在延缓衰老，预防动脉粥样硬化以及减缓癌变的进程等方面有着良好的作用[5]。此外石榴酒中的花色苷和多酚类化合物有明显的抑菌消炎作用和抗癌、抗衰老、抗突变和防癌的作用，能有效地预防疾病的发生[6]。基于其诸多功效，石榴酒具有很好的保健功能，有广阔的应用市场。

斑马鱼是一种亚热带淡水观赏鱼，体型小，繁殖速度快，培育简便快捷，在胚胎发育时期身体透明可见，显微镜下易于观察，被列为继大鼠和小鼠之后的第三大模式生物。皮肤荧光转基因斑马鱼是将荧光蛋白标记在角质细胞上，利用甲硝唑使皮肤细胞消融，然后再加入抗氧化物质，使有一部分皮肤细胞的荧光重新得以表达，从而量化抗氧化物质的抗氧化能力[7]。自由基是客观存在的，过量的自由基对人体造成损害[8]，因此研究具有抗氧化作用的石榴酒意义重大。本文通过体外和体内试验考察石榴酒的抗氧化能力，同时以VC作为对照，为石榴酒的开发和综合利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

石榴酒：山东省科学院药物筛选技术重点实验室采用石榴汁发酵而成；DPPH：梯希爱（上海）化成发展有限公司；Tric-ainc MS222麻醉剂：Sigma公司；水为双蒸水；甲硝唑溶液0.01 mol/L（DMSO溶解）；转基因皮肤荧光斑马鱼cy17（krt4-NTR：GFP）：山东省科学院生物研究所繁殖；VC、DMSO、硫酸亚铁、亚硝酸钠、硝酸铝、水杨酸、氢氧化钠、双氧水、无水乙醇等（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

UV-2100型紫外可见分光光度计：上海合利仪器有限公司；Olympus SZX-16型荧光显微镜：日本Olympus公司；恒温培养箱：上海精宏实验设备有限公司；电热恒温水浴锅：上海贺徳实验设备有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 石榴酒体外抗氧化活性试验

采用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH自由基）法、水杨酸法和邻苯三酚自氧化法来进行抗氧化试验，测定了石榴酒的总还原力，同时以VC为阳性对照。

1.2.1.1 DPPH·的清除试验

用无水乙醇配置100 μmol/LDPPH自由基醇溶液，置于棕色瓶中备用。将3 mL DPPH自由基醇溶液分别加入到 1 mL 含有 5、10、20、30、40 μL 样品的水溶液中，充分混匀，于避光处反应20 min后，在517 nm波长处测定吸光度。同时用VC溶液作阳性对照。DPPH自由基的清除率计算公式为

式中：Ai为样品溶液的吸光度；Aj为石榴酒溶液在测定波长处的吸光度；Ao为未加石榴酒溶液的吸光度。

1.2.1.2 ·OH清除能力的测定

分别取石榴酒 10、80、160、240、320 μL 于试管中，并用双蒸水补齐至2 mL，充分混匀，在反应体系中依次加2 mL浓度为9 mmol/L的FeSO4、2 mL浓度为9 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液、2 mL受试样液、2 mL浓度为8.8 mmol/L的H2O2，混匀后在37℃下启动反应，反应30 min后在510 nm波长处测其吸光值。同时以VC做为阳性对照进行测定，羟基自由基清除率计算公式为

式中：Bi为样品溶液的吸光度；Bj为石榴酒溶液在测定波长处的吸光度；Bo为未加石榴酒溶液的吸光度。

1.2.1.3 O2-·清除能力的测定

分别取石榴酒 10、40、60、80、100、120 μL 于试管中，并用双蒸水补齐至1 mL，混匀后，在反应体系中分别加4.5 mL浓度为0.05 mol/L的Tris-HCl（pH 8.2）缓冲液，于25℃水浴20 min后，再加1.0 mL不同浓度的受试样液和0.5 mL 2.5 mmol/L在25℃下预热过的邻苯三酚溶液，混匀后在25℃下反应5 min后立即用2滴～3滴浓度为8.0 mol/L的HCl溶液终止反应，于320 nm处测吸光值，同时以VC做为阳性对照，超氧离子自由基清除率计算公式：

式中：Ci为样品溶液的吸光度；Cj为石榴酒溶液在测定波长处的吸光度；C0为未加石榴酒时溶液的吸光度。

1.2.1.4 还原能力的测定

用移液枪准确取 40、80、120、160、200 μL 不同梯度体积的石榴酒加入到试管中，用双蒸水补齐至2.5mL，然后加入2.5 mL 0.2 mol/L pH 6.6的H3PO4缓冲液，再添加2.5 mL 1%的K3Fe（CN）6溶液后混匀。置于50℃的水浴锅中反应20 min后，再加入2.5 mL 10%的C2HCl3O2溶液，混匀后在离心机中以3 000 r/min的转速离心10 min，取离心后的上清液5 mL加入已添加0.5 mL 0.1%的FeCl3溶液和4 mL蒸馏水的试管中，混匀。10 min后于700 nm处测定其吸光度。同时以VC作为对照。

1.2.2 斑马鱼体内抗氧化活性的研究

1.2.2.1 斑马鱼抗氧化原理

斑马鱼的皮肤由包膜和基底层组成，形成第一道防御系统。以往研究表明，鱼的皮肤对外部刺激非常敏感，转基因斑马鱼能有条件的引发皮肤表层细胞凋亡。皮肤荧光斑马鱼是将荧光蛋白标记在角质细胞上，对荧光角质细胞进行计数，如果一个细胞内的自由基导致了细胞受损，就会使线粒体膜穿孔，这些小孔会允许细胞色素C到达细胞质中，使得细胞色素C与Apaf-1结合形成聚合体，由ATP提供能量，这些聚合体进而使caspase-9裂解为caspase-3和caspase-7，这些裂解的caspase可以激活蛋白水解酶，使蛋白水解，并降解DNA。通过加入抗氧化物质来清除细胞内的自由基，从而减少细胞凋亡。转基因荧光斑马鱼可通过荧光显微镜观察到皮肤上显示许多绿色的荧光亮斑点，与甲硝唑孵育，会引起细胞凋亡，使荧光斑点消失，当再加入抗氧化物质荧光斑点会恢复[9]。利用此特性进行抗氧化试验，选择皮肤荧光斑马鱼卵黄部位进行拍照，运用Image-Pro软件计数各组的荧光点数量，可以测定药物的相对抗氧化能力。

1.2.2.2 斑马鱼胚胎的准备

斑马鱼的养殖方法参照Westerfield[10]等的方法，选择成熟的斑马鱼，按照雌鱼与雄鱼1∶1或者1∶2的比例置入繁殖缸内，次日清晨取出受精卵，加入亚甲基蓝溶液，放入28℃培养箱中孵化，备用。

1.2.2.3 试验分组与给药

配制浓度分别为 5、10、20、30、40、50 μL/mL 的石榴酒样液，并配制浓度为20、40、100 μg/mL的VC溶液。将孵化24 h的斑马鱼胚胎取出，加入1 mg/mL的链霉蛋白酶溶液中约3 min左右，脱去斑马鱼胚胎的外层卵膜将脱去卵膜的斑马鱼胚胎随机分成4组：溶剂对照组、甲硝唑组、石榴酒组和VC组，每组7个胚胎，同时设置2个副孔，加入到24孔板中，每组试验进行3次。

根据试验分组，在溶剂对照组加入2 mL新鲜培养水，并用新鲜培养水配成0.01 mol/L的甲硝唑溶液。甲硝唑组、石榴酒组和VC组分别加入2 mL 0.01 mol/L的甲硝唑溶液，同时石榴酒组和VC组按照各自的浓度分别加入5 μL溶液，摇匀，将加样后的24孔板置于28℃的恒温培养箱中培养24 h。

将样品板取出后，在荧光显微镜下观察斑马鱼胚胎的生长状况以及皮肤荧光的数量，同时为防止拍照过程中斑马鱼不断的游动，在24孔板的每个带有样品的孔中加入适量的三卡因溶液对斑马鱼进行麻醉，利用Imagepro-plus软件统计各组斑马鱼胚胎表面的荧光点数量，再利用SPSS软件对数据进行统计分析。

2 结果与讨论

2.1 DPPH·的清除试验

DPPH是一种稳定的以氮为中心顺磁化合物，并具有孤对电子，在波长为517 nm处有最大吸收。当抗氧化剂存在时，孤对电子配对成电子对，是自身紫色变成黄色，导致在最大光吸收波长处的吸光值降低，其下降程度与自由基的清除程度呈线性关系，因此可以用分光光度计进行定量测定，从而评价试验样品的抗氧化能力[11]。石榴酒对DPPH自由基的清除作用见图1。

图1 石榴酒对DPPH自由基的清除作用Fig.1 DPPH radical scavenging activity of pomegranate wine

如图1所示，石榴酒对DPPH自由基的清除作用随着样品溶液浓度的增加而增大。在用量为5 μL～20 μL时，石榴酒对DPPH自由基清除率从62.08%增大到92.95%，当用量进一步增加到40 μL时，石榴酒对DPPH自由基的清除率增幅不明显，基本保持不变。对照组 VC在浓度为 0.2 μg/mL～1.0 μg/mL 时对 DPPH自由基的清除率从86.23%增大到94.74%。由此可见，石榴酒对DPPH自由基具有一定的清除效果，用量达到一定量时与VC对DPPH自由基的清除效果相当。

2.2 清除羟基自由基能力的测定

羟基自由基（·OH）是生物体内活性氧代谢产生的物质，是一种氧化性很强的自由基，能引发不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，使机体发生氧化损伤[12]。通过水杨酸法测定石榴酒对羟基自由基的清除能力，Fenton反应产生·OH，·OH氧化水杨酸得到2，3-二羟基苯甲酸，检测其在510 nm处的吸光度来表示·OH的多少，·OH的量与吸光度呈正比[13]。石榴酒对·OH自由基的清除作用见图2。

图2 石榴酒对·OH自由基的清除作用Fig.2·OH radical scavenging activity of pomegranate wine

试验结果如图2所示。在10 μL～320 μL用量范围内，石榴酒对·OH清除率随用量增加而明显增大，清除率从36.41%增加到82.76%，增幅为46.35%，在用量为240 μL时继续增加用量，清除率基本不变，达到最大清除率为82.76%。VC样液浓度在1.0 μg/mL时对羟基的清除率为71.94%，说明石榴酒对羟基自由基有较好的清除作用。

2.3 清除超氧阴离子自由基能力的测定

O2-·是分子氧在生物体内氧化还原反应中产生的活性中间体，正常状态下保持相对稳定的动态平衡，当细胞受到外界刺激时会产生过量的O2-·自由，使细胞产生氧化应激，引起机体病变[14]。运用四甲基偶氮唑盐还原法，邻苯三酚自氧化产生O2-·，O2-·可氧化成四甲基偶氮唑盐生成蓝紫色的化合物，测其吸光度来测定石榴酒样品对O2-·的清除作用，试验结果如图3所示。

图3 石榴酒对O2-·自由基的清除作用Fig.3 O2-·radical scavenging activity of pomegranate wine

由图3可以看出，在20 μL～120 μL用量范围内，石榴酒对超氧阴离子自由基的清除率从59.62%增加到63.85%，增幅为4.23%，说明石榴酒对O2-·有一定的清除作用，清除率在60%左右，相对VC对O2-·的清除作用较弱。

2.4 还原力试验

抗氧化剂通过自身的还原作用给出电子从而清除自由基，因而可通过一种物质还原力的大小来反映这一物质抗氧化能力。据研究，物质的还原力越强，其抗氧化能力越强[15]。通过普鲁士蓝法来测定石榴酒的还原力，其原理是石榴酒将铁氰化钾[K3Fe（CN）6]还原成亚铁氰化钾[K4Fe（CN）6]，亚铁氰化钾再与Fe3+作用，生成亚铁氰化铁即普鲁士蓝，在700 nm波长下测定其吸光度，来表示还原力的大小，吸光度值越大，表明石榴酒的还原力越强[16]。结果如图4所示。

由图 4可以看出，石榴酒用量在 40 μL～120 μL 范围内，吸光度随石榴酒含量增加而增大，最高为0.81，VC溶液浓度在0.8 μg/mL时的吸光度为0.84，吸光度越大说明还原力越大，因此表明石榴酒具有较强的还原力。

图4 石榴酒的还原力大小Fig.4 Reducing capacity of pomegranate wine

2.5 斑马鱼抗氧化活性试验

运用转基因皮肤荧光斑马鱼做石榴酒体内抗氧化试验，试验结果如表1所示，荧光图片如图5所示。

表1 石榴酒对皮肤荧光斑马鱼胚胎生成的影响Table 1 Effect of pomegranate wine on the skin fluorescent zebrafish embryo formation

图5 石榴酒对斑马鱼的抗氧化活性的影响Fig.5 Effect of pomegranate wine on the skin fluorescent zebrafish embryo formation

其中，溶剂对照组荧光点数为（55.2±6.0）个，甲硝唑组荧光点数为（8.8±2.3）个，相对抗氧化能力/%=（加样组荧光细胞数量－甲硝唑组荧光细胞数量）/（溶剂对照组荧光细胞数量－甲硝唑组荧光细胞数量）×100

由表1可见，斑马鱼的皮肤荧光点数最多的是溶剂对照组，当加入甲硝唑后，绝大部分荧光点消失，结果如图5中的B所示，再加入石榴酒样品后，荧光点能够再次更多的被观察到，则说明石榴酒样品具有抗氧化活性，且根据荧光点个数恢复的多少，来判断抗氧化性的强弱。

3 结论

自由基是指能独立存在的，含有一个或多个不配对电子的原子、原子团、离子或分子，本质上具有高度活性和潜在的损伤性，广泛存在于机体组织中。一定数量的自由基对人体是有益的，病毒侵入后，在白细胞的表面就会产生自由基，这些自由基可以作为一种强氧化剂来杀死病毒。但是当自由基超过一定数量时，就会对人体造成损伤，利用抗氧化剂可以对多余的自由基进行淬灭，维护机体健康。本文对石榴酒进行抗氧化活性试验，研究发现石榴酒具有较好的抗氧化能力，样品加入量在一定范围内对DPPH·、·OH和O2-·的清除率随着加入量的增大而升高，有着明显的量效关系，清除率最大分别为92.95%、82.76%和63.85%。在还原力试验中，吸光度最高为0.81，与VC相比相差不大，说明石榴酒具有较好的还原力。

斑马鱼的鱼皮缺乏角质层，直接由活细胞组成最外层皮肤，当遇到恶劣外界环境时角质细胞会发生凋亡。本研究利用甲硝唑使皮肤细胞消融，然后再加入抗氧化物质，减少了细胞毒性，使部分细胞恢复活性，一部分皮肤细胞的荧光重新得以表达，从而量化抗氧化物质的抗氧化能力。在本试验中通过添加甲硝唑消除皮肤荧光点后，再添加石榴酒后，能够重新在荧光显微镜下观察到斑马鱼皮肤表面的荧光点，添加量为50 μL/mL时，相对抗氧化能力可达到75.4%，说明石榴酒具有良好的抗氧化活性。本研究表明石榴酒有较好的抗氧化活性，为石榴酒的开发利用提供了理论依据。

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Research in the Antioxidant Activity of Pomegranate Wine in vitro and Zebrafish in vivo

ZHANG Hong-ya1，2，WANG Zhen-guo3，LIU Bang-gang3，CHU Jie2，*，LIU Ke-chun2，YANG gui-wen1，*
（1.Life Sciences Institute，Shandong Normal University，Jinan 250014，Shandong，China；2.Shandong Provincial Engineering Laboratory for Biological Testing Technology/Shandong Provincial Key Laboratory of Biosensors/Key Laboratory for Drug Screening Technology of Shandong Academy of Sciences，Institute of Biology，Shandong Academy of Sciences，Jinan 250014，Shandong，China；3.School of Medicine and Life Sciences，University of Jinan-Shandong Academy of Medicine Sciences，Jinan 250002，Shandong，China）

2017-02-21

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.19.005

张洪亚（1992—），女（汉），在读硕士研究生，生物工程专业。

*通信作者：楚杰（1965—），女（汉），研究员，主要从事微生物发酵方面的研究；杨桂文（1967—），男（汉），教授，硕士生导师，主要从事细胞生物学方面的研究。