酿酒甘蔗汁酶解工艺研究

朱香澔，曹雨珊，伍淑婕，*，罗杨合，*，苏丽玲

（1.贺州学院食品与生物工程学院，广西贺州542899；2.大连工业大学食品学院，辽宁大连116034）

酿酒甘蔗汁酶解工艺研究

朱香澔1，2，曹雨珊1，伍淑婕1，*，罗杨合1，*，苏丽玲1

（1.贺州学院食品与生物工程学院，广西贺州542899；2.大连工业大学食品学院，辽宁大连116034）

甘蔗汁酿造果酒可通过果胶酶酶解处理降低其甲醇含量。以D-半乳糖醛酸含量为考察指标，通过单因素和正交试验得出甘蔗汁酶解的最佳工艺条件：酶解温度为60℃、酶解时间为3.5 h、酶解量为1.0%、酶解pH值为2.5，在此条件下酶解所得甘蔗汁中的D-半乳糖醛酸含量最高为85.5 mg/mL，酶解处理效果最好。

甘蔗汁；酶解；果胶酶；D-半乳糖醛酸

Abstract：In the process of making wine by sugarcane juice，the content of methanol and the clarity of wine could be ruduced by enzymolysis with pectinase.The optimum conditions for enzymatic hydrolysis of sugarcane juice were obtained through single factor and orthogonal experiment，and the content of D-galactose acid was used as the index.The result was showed as follows：the temperature and time of enzymatic hydrolysis was 60 ℃and 3.5 h respectivily，the pectinase dosage was 1.0%，the enzymatic hydrolysis of pH was 2.5，in these conditions the content of D-galacturonic acid in sugarcane juice was the highest of 85.5 mg/mL by enzymatic hydrolysis，the effect of enzymatic treatment was best.

Key words：sugarcane juice；enzymatic hydrolysis；pectinase；D-galacturonic acid

甘蔗，是禾本科甘蔗属（SaccharumL.）多种植物的统称，约12种，分布在热带、亚热带地区[1]。甘蔗具有多种营养物质，其中糖分和水分含量比较高，同时在甘蔗汁中含有有助于人体新陈代谢的铁、钙、磷、锰、锌等矿物质元素[2]。由于甘蔗汁经过发酵后在甘蔗果酒中富含多种不同的有机酸类和多酚类物质，因此经常饮用甘蔗果酒能美容养颜、延缓衰老[3]。但甘蔗汁中的粗果胶含量较多为565 mg/100 mL[4]，在甘蔗果酒发酵过程中，微生物会对原料中的果胶质、甘氨酸、纤维素等成分进行发酵利用产生甲醇。甲醇对人体视网膜细胞有极强毒性，严重会导致失明和严重酸中毒，成人饮用5 mL～10 mL甲醇后即会出现中毒现象，甲醇致死量约50 mL[5]；在果酒酿造过程中生成杂醇油也称高级醇，而杂醇油主要是由蛋白质和糖类的代谢产物转化形成[6]，同时杂醇油也是酒食品工业的副产品[7]，其产生决定于酶、含氮物质的添加及发酵和精馏条件[8]，它虽然是果酒香味的主要构成物质之一，但含过多的杂醇油除了会对果酒的风味产生不良影响[9]，所以甲醇含量是果酒的主要限量指标之一[10]。此外，水果中高含量的果胶会使压榨与澄清困难，形成分层和浑浊[11]，因此甘蔗汁酿酒前进行果胶酶酶解处理，快速脱除果胶[12]等物质对降低甲醇含量和提高酒体澄清度是极其必要的。

果胶酶是一组能高效降解果胶以及其他导致混浊的阿拉伯聚糖、纤维素、半纤维素、淀粉、蛋白质等不溶性物质，保证产品良好澄清度的酶系，主要包括原果胶酶、果胶多聚半乳糖醛酸酶、聚半乳糖醛酸裂解酶和果胶甲酯水解酶、果胶裂合酶等[13]。果胶酶在食品工业的应用很多，主要用于葡萄籽多酚提取、水果及饲料加工等方面[14-16]。在果汁加工过程中加入果胶酶可以酶解果胶降低果汁的黏度，使得果汁在过滤过程中可以缩短过滤时间，同时具有加速和增强果汁的澄清作用，能够提高果汁出汁率等[17-24]。果胶酶的使用在降低甲醇方面也有相关的研究，在果酒的发酵前期使用果胶酶对果胶进行酶解能够降低果酒中的甲醇和杂醇油的产生，提高产品的质量[25]。

本研究选择适合果汁专用的酸性果胶酶，其适宜pH值在3.0～6.0之间，为后续的酒精发酵提供有利环境，在此基础上进行甘蔗汁酶解工艺研究，为酿造低度甘蔗汽酒的原材料预处理提供了科学参考。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

黑皮甘蔗：贺州市八步区三加村，榨汁4℃短时间冷藏备用；酸性果胶酶（食品级，1 000 U/mL）：广州明曜公司。

DNS（3，5-二硝基水杨酸）、四水合酒石酸钾钠、苯酚、无水亚硫酸钠、氢氧化钠、柠檬酸、磷酸氢二钠（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

722型分光光度计：上海分析仪器总厂；AR224CN电子分析天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司；HH-S恒温水浴锅：江苏国胜实验仪器厂；FG2-FK型手持便携式酸度计：北京赛多利斯；SXZ-80齿轮箱甘蔗榨汁机：浙江应晓有限公司。

1.2 方法

1.2.1 甘蔗汁最佳酶解工艺条件的探究

量取100.0 mL/组的甘蔗汁5组，每组3个平行进行酶解试验，基础试验条件为：果胶酶用量（质量比，以甘蔗汁质量计）0.50%，pH=3.0，酶解时间3.5 h，酶解温度50℃。变量分别进行以下调整：果胶酶用量为0.30%、0.50%、0.70%、0.90%、1.10%；pH 值分别为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5；酶解时间设为 2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 h；酶解温度分别为 40、45、50、55、60、65 ℃，根据以上变量进行各单因素试验，酶解处理后测甘蔗汁中D-半乳糖醛酸含量，考察酶解温度、酶解时间、果胶酶用量和酶解pH值等因素对果胶酶解的影响。通过单因素试验结果分析获得各因素适宜水平值，设计正交水平表进行L9（34）试验，仍以D-半乳糖醛酸含量为检测指标，并对指标值进行极差分析。

1.2.2 D-半乳糖醛酸的测定

D-半乳糖醛酸参考3，5-二硝基水杨酸（DNS）法[26]进行测定。

准确吸取1.0 mg/mL的D-半乳糖醛酸标准溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL、分别加入 7 支试管中，再分别加入3.5 g/L的3，5-二硝基水杨酸溶液4 mL，而后以pH值为4.6的柠檬酸-磷酸缓冲溶液加至8 mL，再将8支试管沸水浴5 min后流水冲洗迅速冷却至室温，摇匀，以1号试管为空白，在波长540 nm下测定其吸光值见图1。

图1 D-半乳糖醛酸标准曲线Fig.1 Standard curve of D-galacturonic acid

由图1可知，吸光度值与D-半乳糖醛酸浓度成线性关系，回归方程为：为y=0.694 7x-0.012 5，R2=0.999，浓度线性范围为0.0～1.0 mg/mL。待测样品中的D-半乳糖醛酸含量可根据此公式计算得来。

2 结果与分析

2.1 甘蔗汁最佳酶解工艺条件的确定

2.1.1 果胶酶用量对果胶酶酶解效果的影响

果胶酶用量对酶解后D-半乳糖醛酸含量的影响见图2。

图2 果胶酶用量对酶解后D-半乳糖醛酸含量的影响Fig.2 Effect of pectinase dosage on the content of D-galacturonic acid

由图2可知，果胶酶用量（质量比）对甘蔗汁中果胶的酶解效果影响明显，呈现正相关的关系。当果胶酶用量在0～0.9%之间递增时，甘蔗汁中D-半乳糖醛酸含量显著增加。果胶酶用量的增加使果胶、纤维素等大分子物质的分解更加充分，所以酶解产物含量D-半乳糖醛酸含量不断增加。继续增加果胶酶用量时，酶解液中D-半乳糖醛酸含量变化不大，说明甘蔗汁中果胶质与纤维素已酶解较为彻底，出于对成本考虑，确定果胶酶的适宜用量为0.9%。

2.1.2 酶解pH值对果胶酶酶解效果的影响

酶解pH值对酶解后D-半乳糖醛酸含量的影响见图3。

图3 酶解pH值对酶解后D-半乳糖醛酸含量的影响Fig.3 Effect of enzyme solution pH on the content of D-galacturonic acid

每一种酶都具有最适的pH值，在最适的pH值条件下，活性最大。从图3可知，该酸性果胶酶系对pH值的适宜范围在2～3.5之间，在pH 2～3.5的范围内，随着pH值的升高，甘蔗汁中果胶的酶解产物D-半乳糖醛酸含量逐渐上升，而后趋于平稳，这是由于随着pH值的增加，果胶酶的活性也随着增加；pH值为3.0时，甘蔗汁中的D-半乳糖醛酸含量最高，为52.3 mg/mL；当pH＞3.5时，酶活逐步受到抑制并迅速下降，pH=4时，甘蔗汁中的D-半乳糖醛酸含量迅速将至31.8 mg/mL，可见该果胶酶系适于低pH值环境，同时低pH值有利于酶解过程中杂菌的抑制，保证了甘蔗汁原料在杂菌污染方面的控制。

2.1.3 酶解时间对果胶酶酶解效果的影响

酶解时间对酶解后D-半乳糖醛酸含量的影响见图4。

图4 酶解时间对酶解后D-半乳糖醛酸含量的影响Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis time on the content of D-galacturonic acid

从图4可知，随着果胶酶酶解处理时间的增加，甘蔗汁中D-半乳糖醛酸的含量先逐步上升，在处理3.5 h时达到48.8 mg/mL，此后含量趋于平稳。这是因为在果胶酶酶系中，原果胶酶使天然果胶转变为可溶性果胶，而果胶甲酯水解酶催化果胶甲基化作用产生果胶酸（聚半乳糖醛酸盐）后，聚半乳糖醛酸酶和果胶裂合酶均可作用于果胶或果胶酸，其中聚半乳糖醛酸酶的外切和内切活性能水解果胶中的α-1，4糖苷键生成D-半乳糖醛酸和寡聚半乳糖醛酸等降解物，而果胶裂合酶则可通过β-消除机制断裂聚半乳糖醛酸盐或果胶链，导致在非还原性末端的C4和C5间形成一个双键，生成不饱和半乳糖醛酸[13，27]。因此，随着果胶酶处理时间的延长，在此一系列的酶解反应中，甘蔗汁中逐步产生半乳糖醛酸、寡聚半乳糖醛酸、不饱和半乳糖醛酸和寡聚半乳糖酸等降解物在3.5 h之后趋于稳定。

2.1.4 酶解温度对果胶酶酶解效果的影响

酶解温度对果胶酶酶解效果的影响见图5。

由图5中可知，随着酶解处理温度的升高，甘蔗汁中D-半乳糖醛酸含量先升后降。当酶解温度60℃时，D-半乳糖醛酸含量达到最高值56.9 mg/mL，说明此时的温度为酶解适宜温度，当温度提高到65℃后，超出果胶酶的最适酶解温度酶活下降，D-半乳糖醛酸含量下降。

图5 酶解温度对酶解后D-半乳糖醛酸含量的影响Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the content of D-galacturonic acid

2.1.5 果胶酶酶解甘蔗汁最佳条件组合的确定

根据单因素试验结果分析，以果胶酶用量、酶解pH值、酶解时间、酶解温度四因素进行L9（34）正交试验，测酶解后甘蔗汁中的D-半乳糖醛酸含量，试验结果见表1。

表1 果胶酶酶解对酶解效果影响的正交试验结果Table 1 Orthogonal test results of pectinase hydrolysis conditions on the effect of enzymolysis

从表1可知，5号试验组的D-半乳糖醛酸含量实测值最高。经极差分析可知，对果胶酶酶解效果影响的主次因素顺序为：酶解温度＞果胶酶用量＞酶解时间＞酶解pH值，果胶酶酶解的最佳工艺条件组合为A3B3C3D1，即酶解温度为62℃、酶解时间为4 h、果胶酶用量为1.0%、酶解pH值为2.5。统计分析的结果与实际试验所得的组合有所不同，为进一步验证统计分析所得的最佳工艺条件组合与5号试验组组合的酶解效果，因此进行了以下试验验证。

2.2 验证试验

将正交试验组中酶解效果最好的组合A2B2C3D1与经正交试验极差分析所得的最优组合A3B3C3D1进行对比试验验证，测其D-半乳糖醛酸含量，结果见表2。

表2 果胶酶酶解最佳条件组合验证试验结果Table 2 Result of verification test of optimum condition combination with pectinase hydrolysis

从表2可知，经过验证试验后的A2B2C3D1组合比A3B3C3D1组合酶解后的D-半乳糖醛酸含量高，即果胶酶酶解甘蔗汁的最优工艺条件为：酶解温度为60℃、酶解时间为3.5 h、果胶酶用量为1.0%、酶解pH值为2.5。

3 结论

以贺州黑皮甘蔗为原料进行榨汁，然后加入果胶酶对甘蔗汁进行果胶酶酶解工艺的研究。经过试验得到果胶酶酶解甘蔗汁处理的最佳酶解工艺条件为：酶解温度为60℃、酶解时间为3.5 h、酶解量为1.0%、酶解pH值为2.5，此时甘蔗汁中酶解降解物D-半乳糖醛酸含量为85.5 mg/mL，酶解效果最好，有利于后续酿酒过程中甲醇含量的控制及果酒的澄清。

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Study on Enzymatic Process of Sugarcane Juice for Brewing

ZHU Xiang-hao1，2，CAO Yu-shan1，WU Shu-jie1，*，LUO Yang-he1，*，SU Li-ling1
（1.Food Science and Biology Technology Engnieering Institute，Hezhou University，Hezhou 542899，Guangxi，China；2.School of Food Science and Technology，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，Liaoning，China）

2017-06-12

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.19.012

国家自然科学基金（21365011）；广西高校重点学科“农产品加工及贮藏工程”桂教科研（[2013]16-123）；贺州学院博士科研启动基金项目（HZUBS201608）；贺州学院教授科研启动基金项目（HZUJS201613）

朱香澔（1992—），男（汉），在读硕士研究生，研究方向：农产品加工。

*通信作者：伍淑婕（1973—），女（汉），副教授，研究方向：农产品加工及贮藏。