庆大霉素发酵培养基优化的研究

严宝冬

黑龙江格林赫思生物科技有限公司 大庆 166400

庆大霉素发酵培养基优化的研究

严宝冬

黑龙江格林赫思生物科技有限公司 大庆 166400

目的：对庆大霉素发酵的培养基配方进行优化，通过对几种主要原辅料玉米淀粉、玉米粉、黄豆饼粉、蛋白胨、轻质碳酸钙的用量进行调整，最后确定的培养基组合大大提高了发酵生产水平，而且降低了生产成本。

庆大霉素；培养基；发酵；优化

庆大霉素是一类由微生物或其他生命过程中合成的次级代谢产物或其人工衍生物，它们在很低浓度时就能抑制或干扰它种生物（包括病原菌，病毒，癌细胞等）的生命活动，因而可用作优良的化学治疗剂，也是临床上广泛使用的处方药。庆大霉素属于氨基糖苷类抗生素，主要是由绛红小单孢菌（Micromonospora purpurea）、棘孢小单孢菌（M.echinospora）发酵产生的一种杀菌力较强的多组分氨基糖胺类广谱抗生素。1963年由美国先令公司Weinstein等发现，1969男被用于临床，国外称之艮他霉素或正泰霉素。庆大霉素同时也是我国独立自主研制成功的广谱抗生素。1966年，我国著名的微生物学家王岳和助手从小单孢菌中分离到全国闻名的庆大霉素产生菌，并且在 1967年开始研制，到1969年底获得成功。之所以取名“庆大霉素”，是为了庆祝“九大”以及工人阶级的伟大胜利。目前，庆大霉素仍然是临床上和畜牧业治疗各种革兰氏阴性菌感染的主要抗生素之一。因此，庆大霉素的相关研究仍然具有重要意义。

我国庆大霉素的生产历史已经有四十余年，国内生产庆大霉素的生产厂家主要为福抗、烟台只楚药业、南阳普康集团、上海先锋，总体来说生产水平不高，生产工艺改进也不大，生产菌种大多选择绛红小单孢菌，一般采用深层液态发酵法，国内生产水平一般维持在1200-1400U/ml左右，产量较低。国外生产菌株多使用棘孢小单孢菌或橄榄星小单孢菌，发酵周期较长、成本较高，这也使得生产受到一定的限制。

目前对于庆大霉素提高单位效价的措施主要是优良菌种的筛选和工艺的优化两种方式。大多数工厂对庆大霉素提高发酵单位的措施主要是工艺优化。虽然国内外众多科研工作者曾经致力于采用传统的诱变育种手段来改造小单孢菌的生物合成，但是往往收效甚微。

庆大霉素生产的培养基主要为玉米淀粉、玉米粉、黄豆饼粉、蛋白胨、轻质碳酸钙，本文主要针对这几种培养基的最佳用量进行正交化组合，得到最佳的培养基用量组合，从而提高庆大霉素的发酵生产水平。

1.资料和方法

1.1 菌种：绛红小单孢菌（黑龙江格林赫思生物科技有限公司生产用菌种）。

1.2 培养基

玉米淀粉、玉米粉、黄豆饼粉、蛋白胨、轻质碳酸钙、硫酸铵、硝酸钾等。

1.3 设备

1.3.1 实验室设备：摇瓶机，500ml三角瓶

1.3.2 发酵罐：1500L发酵罐

1.4 培养方法

1.4.1 摇瓶发酵

将子瓶斜面菌种在无菌室内挑取2cm2接种于灭菌后的摇瓶培养基中，每瓶500ml三角瓶装量50ml培养基，37±1℃、360r/min培养135小时，放瓶取样，检测庆大霉素生物效价及其组分比例。

1.4.2 1500L发酵罐发酵

将5瓶子瓶斜面菌种在无菌室用无菌水洗下，制成孢子悬浮液，将孢子悬浮液接入1500L发酵罐，罐压0.05Mpa，通气量1:1，搅拌速度120r/min，，发酵培养135小时 ，放罐，测定庆大霉素生物效价及其组分比例。

1.5 效价测定

采用抗生素微生物检定法。

2 结果与讨论

2.1 摇瓶发酵结果

2.1.1 正交法设计实验

发酵试验的影响因素很多，培养基中主要是碳源氮源，为菌体生长提供了大部分能量，所以选择培养基中5个主要因素进行研究：玉米淀粉、玉米粉、黄豆饼粉、蛋白胨、轻质碳酸钙，根据单因子实验结果确定各因素的最佳含量范围，采取五因素三水平正交试验模式，因素水平表见表1。

表1 正交试验水平表

按照四水平五因素的实验安排，共做 16组实验，每一组实验平行5瓶，所得结果为5瓶的平均结果，实验结果见表2。

表2 L9（35）正交试验结果

从表2中极差可以看出，以上5个因素对庆大霉素产量影响的顺序为：玉米淀粉＞蛋白胨＞黄豆饼粉＞玉米粉＞轻质碳酸钙，实验组中最佳结果是第八组，（A2B4C3D2E1），从分析数据中得出，最优培养基配方为A2B4C3D2E1，通过验证试验得出，这个配方的庆大霉素效价最终保持在1450u/ml左右，产量稳定。根据原始配方，平行做出现用的培养基发酵试验，最终效价稳定在1200u/ml左右，新的最优配方效价提高了16.7%。

所以确定最终培养基配方为玉米淀粉5.5g/L，玉米粉1.6g/L，黄豆饼粉4.0g/L，蛋白胨0.65g/L，轻质碳酸钙0.6g/L。

2.2 1500L吨发酵罐验证结果

将优化的培养基配方在1.5吨发酵罐上进行验证，连续上罐7次，其结果见表3

从表3可以看出，庆大霉素的发酵过程中，应用新的最优培养基配方，连续实验效果很稳定，并且经过成本核算，生产成本较原有的培养基配方成本低，增加了生产利润，降低了单位能耗。

3 结语

本实验所采用的优化培养基发酵所得结果，各组分比例满足新药典要求，并且杂志显著降低，为下游的色谱分离工作带来很大便利。

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