高效液相色谱法测定金银花连翘提取物中绿原酸、咖啡酸的含量

刘爱华

哈药集团三精制药有限公司 150000

高效液相色谱法测定金银花连翘提取物中绿原酸、咖啡酸的含量

刘爱华

哈药集团三精制药有限公司 150000

金银花是通过一种常见的中药药材，药性甘、寒，因为具有清热解毒的疗效，临床医学中常被用以治疗风寒感冒、热毒血痢等疾病。高效液相色谱法由于其独有的先进性和科学性，常被化学、医学、工业等领域用来进行成分分离和检定工作。本文将对采用高效液相色谱法测定金银花连翘提取物中绿原酸、咖啡酸的含量的实验进行简要介绍和分析，希望能为广大医疗工作者的工作提供几点值得参考的意见。

高效液相色谱法；金银花；连翘；提取物；绿原酸；咖啡酸；含量

金银花作为一种常见的中药药材，在临床医学实验中得到了广泛的应用。而金银花的连翘部位，由于其含有绿原酸和咖啡酸等物质，在医学实验中，也有其特殊用途。本文将对才有高效液相色谱法测定金银花连翘提取物中绿原酸、咖啡酸的含量的实验进行简要分析，希望可以得出有用的结论。

金银花也被成为忍冬，由于其开花时独特的颜色变化而得名金银花。金银花在临床医学中的应用非常广泛，由于其能够清热解毒、抗炎、凝血等作用，常被用于治疗外寒感冒、温病发热等疾病。与此同时，金银花也可以与其他药材搭配，缓解人体口干、烦闷等不良症状，也可以用于呼吸道类疾病的治疗。金银花这味药材有多种入药形式，其中提取物的形式在目前的制药过程中被最为广泛的使用。通常情况下，金银花提取物可以直接以煎煮的形式，通过半成品的形式被使用。另一方面，也可以通过一定的手段对金银花的含有药效的部位进行提取之后，再入药使用。为了保证药品中金银花提取物的含量，通过科学的方法及相关实验准确的测量其有效部位提取物中的绿原酸和咖啡酸的含量非常有必要。

1.验仪器与药品的选择

合理的选择实验所用的仪器和药品样品，将能够对准确测得实验数据起到一定的保障作用，因此，选择过程必须严格遵循相关规定。

Agilent 1100 series高效液相色谱仪(G 1322A排气阀,G 1311A泵,G 1316A柱温箱,G 1314A紫外检测器),chemistation色谱工作站,KromasilC18色谱柱,超声提取器(KQ 3200DE型数控超声仪昆山市超声仪器有限公司);绿原酸对照品(中国药品生物制品鉴定所,批号110753- 200212),金银花提取物(本实验室自制),乙腈,磷酸均为分析纯;水为双蒸水。

2 实验的方法、过程与结果

2.1 高效液相色谱法

高效液相色谱法的合理应用能够比较科学、准确地测出实验所需数据，因此，本实验选择应用高效液相色谱法。实验过程中，必须满足该方法的应用要求。

液相色谱和质谱连接，可以增加额外的分析能力，能够准确鉴定和定量像细胞和组织裂解液，血液，血浆，尿液和口腔液等复杂样品基质中的微量化合物。高效液相色谱质谱系统（ABSciex Eksigent LC / MS和LC / MS / MS）提供了一些独特的优势，包括：

(1)快速分析和流转所需的最少样品准备

(2)高灵敏度并结合可分析多个化合物能力，甚至可以跨越化合物的种类

(3)高精确度，高分辨率鉴定和量化目标分析物

高效液相色谱法有“四高一广”的特点：

①高压：流动相为液体，流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压。

②高速：分析速度快、载液流速快，较经典液体色谱法速度快得多，通常分析一个样品在 15～30分钟，有些样品甚至在 5分钟内即可完成，一般小于1小时。

③高效：分离效能高。可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。

④高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng，进样量在μL数量级。

⑤应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析，显示出优势。

⑥柱子可反复使用：用一根柱子可分离不同化合物

⑦样品量少、容易回收：样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。

此外高效液相色谱还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优点，但也有缺点，与气相色谱相比各有所长，相互补充。高效液相色谱的缺点是有“柱外效应”。在从进样到检测器之间，除了柱子以外的任何死空间（进样器、柱接头、连接管和检测池等）中，如果流动相的流型有变化，被分离物质的任何扩散和滞留都会显著地导致色谱峰的加宽，柱效率降低。高效液相色谱检测器的灵敏度不及气相色谱。

2.1.1 色谱

高效液相色谱法的应用，对色谱有着比较高的要求。本实验选用了我国制造生产的KromasilC18液相色谱柱。实验过程中，控制了色谱柱温度保持在25摄氏度，选用12单位的乙腈和88单位的0.4%的磷酸作为实验的流动相。与此同时，实验过程中，流速控制在1ml/min的状态下，实验使用的检测波长为327nm。

2.1.2 实验环境

由于实验的环境 ph值，将对实验结果产生影响。因此必须对其进行严格的控制。由于绿原酸是有机酸的化学特性。在进行高效液相色谱法进行实验时，为避免出现前沿或拖尾峰的现象，需要在实验的流动相中加入某种酸性物质。本实验对流动相中加入乙酸和磷酸的情况进行了对比，可知选用 0.4%的磷酸，能够得到所需的色谱峰形。

2.1.3 色谱系统适应性实验

在选定条件下,绿原酸和样品中其他组分可基线分离,绿原酸与其相邻色谱峰的分离度大于1.5,理论塔板数(N)为5 000以上。结果见图1。

图1 金银花提取物高效液相色谱法图谱

2.2 对照品溶液的制备

精密称取绿原酸对照品适量,置棕色量瓶中,加 50%甲醇制成每毫升含35.8μg的溶液,即得。

2.3 供试品溶液的制备

精密称取本提取物10mg,置100ml容量瓶中,双蒸水溶解,超声2min后,再用双蒸水定容至刻度,摇匀,过0.45μg微孔滤膜,取续滤液即得。

2.4 线性范围的考察及其标准曲线的绘制

精密吸取对照品溶液 2, 4,6,10,14,18μl,分别注入液相色谱仪。按上述色谱条件测定峰面积。以峰面积积分值(A)对进样量进行回归,得回归曲线方程:Y=2468.4X-16.205,r= 0.9996。结果表明,绿原酸在0.071 6～ 0.644 4μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。结果见图2。

图2 绿原酸标准曲线

2.5 精密度实验精密吸取对照品溶液10μl,按上述色谱条件重复进样6次,记录各组绿原酸峰面积值,结果平均峰面积为:840.5,RSD为0.69%(n=6)。

2.6 稳定性实验

取同一供试品溶液,分别于0,2,4,6,8h进样10μl,测得绿原酸的平均峰面积值为:680.24,RSD为:0.38%(n= 5),表明供试品溶液在8h内稳定。

2.7 重复性实验

取同一批号(070204)样品 6份,按含量测定方法测定,结果绿原酸平均含量为28.01%,RSD为1.07%(n=6)。

2.8 加样回收率实验

精密称取已知含量的金银花提取物6份,分别精密添加绿原酸对照品适量,按供试品溶液的方法制备,测定,计算回收率。结果见表1。

表1 加样回收率实验结果

2.9 样品测定

取 3批样品,按照上述方法制备供试品溶液,进样 10μl,依照已确定的色谱条件测定,按峰面积值用外标法计算样品中绿原酸的含量。结果见表2。

表2 样品含量测定结果（%）

3 讨论

金银花提取物以有机酸为有效成分,本实验以绿原酸含量作为金银花提取物的质量控制指标,同时测定了 3批金银花提取物中绿原酸的含量,通过计算,其含量均在 20%以上。本文所建立的方法简便、快捷,重复性及稳定性均较好,可在实际生产中用于该提取物的质量控制。本文所做的工作为开发金银花的相关产品提供了质量监控方法。

金银花是一种常见且应用广泛的中药药材，对其合理的运用能够以相对低廉的价格进行多种疾病的治疗。而连翘作为金银花的主要药效部位，对其合理的运用，能够使其中的绿原酸和咖啡酸发挥出应有的效果。在临床医学中，医学工作者应加强对金银花的了解，使这种药材发挥出它能起到的最大的药理作用。

[1]于生兰,张龙,孙玲.金银花的研究进展[J].时珍国医国药,2002,13(8):498.

[2]李喜香,杜景云,吴玲燕.HPLC法测定附炎清灌注液中绿原酸的含量[J].中药新药与临床药理,2004,15(1):48.

[3]邓良,袁华,喻宗沅.绿原酸的研究进展[J].化学与生物工程,2005,7:4.

[4]国家药典委员会.中国药典,Ⅰ部[S].北京:化学工业出版社,2005:152.

[5]刘恩荔,李青山.高效液相色谱法测定金银花有效部位中绿原酸的含量[J].山西医科大学学报,2006,37(2):166.

R 473.5

A< class="emphasis_bold">[文章编号]1

1672-5018（2017）03-035-02