长链非编码H19靶向调节miR-107通过Notch通路对肺癌的侵袭迁移的影响

李纪远 张灿斌 马 新 王 强 王 献 郑帅玉

(河南科技大学第一附属医院胸外科，洛阳471000)

长链非编码H19靶向调节miR-107通过Notch通路对肺癌的侵袭迁移的影响

李纪远 张灿斌 马 新①王 强 王 献 郑帅玉

(河南科技大学第一附属医院胸外科，洛阳471000)

目的：探讨长链非编码H19靶向调节miR-107通过Notch通路对肺癌的侵袭迁移的影响情况。方法：qPCR检测肺癌和癌旁组织、不同肺癌细胞中H19的表达情况；Transwell侵袭实验检测沉默H19后肺癌细胞侵袭能力的变化；划痕实验检测沉默H19后肺癌细胞迁移能力的变化；双荧光素酶报告基因检测H19与miR-107的相互作用；qPCR检测肺癌和癌旁组织、不同肺癌细胞中miR-107的表达情况；Transwell侵袭实验检测沉默H19后miR-107对肺癌细胞侵袭能力的影响；划痕实验检测沉默H19后miR-107肺癌细胞迁移能力的影响；裸鼠皮下成瘤检测沉默H19后miR-107对肺癌成瘤大小以及体积的影响。Western blot检测沉默H19后Notch通路蛋白的表达情况。结果：与癌旁组织相比，肺癌组织中H19表达明显增高；肺癌细胞A549中H19表达水平最高；沉默H19可以抑制肺癌细胞侵袭和迁移能力；H19能与miR-107的3′UTR特异性结合；与癌旁组织相比，肺癌组织中miR-107表达明显降低；沉默H19后，抑制miR-107可以促进肺癌细胞侵袭和迁移能力；与H19-siRNA组相比，H19-siRNA+miR-107-inhibitor组荷瘤小鼠肿瘤体积和重量都明显增大。沉默H19后Notch通路蛋白表达情况相应下调。结论：H19在肺癌发生发展过程中起重要作用，H19可以靶向调节miR-107通过Notch信号通路调控肺癌细胞的侵袭和迁移能力。

H19；肺癌；miR-107； 侵袭试验

近年来，肺癌发病率和死亡率呈急剧上升趋势，而化疗耐药已成为当今肺癌治疗中亟需解决的一大难题[1]。近30年以来晚期肺癌患者的5年生存率依旧徘徊在20%左右，尽管经肿瘤细胞减灭术和化疗等治疗，但80%左右患者仍会出现耐药及复发的情况[2,3]，随着分子生物学研究的深入，迫切需要新的分子靶向治疗策略提高晚期肺癌患者的生存率。

H19基因在多种哺乳动物中都呈现高表达状态，主要在肺、肝及胰腺组织中表达[4]。然而在人类中，仅在心脏和肌肉中存在[5]。H19基因主要包含5个外显子集团及4个内含子集团，本身不能编码相关蛋白，缺乏开放编码区，是非编码RNA的一种[5]。尽管在细胞核、细胞浆都可以检测H19的表达，但H19主要表达区域是细胞浆，在细胞核中存在很少，可以调控下游蛋白发挥作用[6]。

微小RNA(miRNAs)是一种广泛存在的单链RNA分子，对下游信使蛋白的表达有促进或抑制的作用[7]。在人类肿瘤基因富集区域，存在大量的miRNA，影响着促癌基因和抑癌基因的突变行为，为恶性肿瘤的诊断、治疗及预后提供研究靶点[8]。有研究表明，在肺癌组织中存在很多miRNA表达异常的情况[9]。近年有报道指出，肺癌、乳腺癌、胆管癌等不同类型的肿瘤组织中都存在miR-107的异常表达，提示miR-107在肿瘤的生物学进展中可以起到一定作用[10]。

Notch家族成员是多种肿瘤中共存的信号通路，对增殖、侵袭、转移等细胞行为起到关键的调控作用，其中在宫颈癌、结肠癌、卵巢癌中Notch通路呈现持续激活的状态[11-13]， Notch信号通路不仅可以扮演促进肿瘤发生的作用，还可以为肿瘤的治疗方向提供理论帮助。本研究拟分析H19在肺癌中的表达情况，并进一步探讨H19与miR-107的相互作用，明确二者在肺癌的迁移侵袭过程中的作用

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1临床标本采集及处理 收集2015年3月～2016年5月在我院收治的40例肺癌患者的癌和癌旁组织40例。所有患者术前无化疗或放疗，全部患者术后病理分期均经2名副高以上病理科医师共同阅片确定，肿瘤组织离体后迅速投入RNA保存液中。

1.1.2细胞株与主要试剂 人细胞 A549、PGCI3、PAa及H1299均购于上海中山细胞库，用含有10%胎牛血清的 DMEM 培养液在 37℃、 5%CO2的培养箱中培养和传代。胎牛血清，RPMI1640培养基均购自Hyclone公司(Hyclone,Logan,UT)。Transwell小室购自美国Millipore公司(Millipore,Billerica,MA)，Matrigel购自Bio-Rad (Bio-Rad,Madrid,Spain)。脂质体Lipofectamine 2000、miR-107-inhibitor购自Gnenpharma(Gnenpharma Co.,Shanghai,China)，Trizol购自Ambion(Ambion Inc.,Austin,TX,USA)，逆转录试剂盒(FSQ-101)购自日本ToYoBo公司(ToYoBo,FSQ-101,Japan)，PCR试剂盒购自美国Sigma公司(KapaBiosystems Inc.,Boston,US)。荧光素酶活性检测试剂盒购自Promega公司。荧光素酶报告载体由Promega公司合成(Promega Biotech Co.,Beijing,China)。

1.2方法

1.2.1qPCR检测H19的表达 qPCR法检测H19表达 将不同组细胞分别接种于培养瓶，接种密度为1×106ml-1， 培养36 h后按照Trizol说明操作提取组细胞总RNA，使用紫外分光光度计检测核酸的浓度和纯度。以DEPC水将各组总RNA稀释调整为同一浓度，按步骤加入试剂，反应完成后将 cDNA 于-20℃储存备用。每组反应体系的体积为20 μl， 并各设置3个复孔， 每组样本cDNA 均需行目的RNA和内参基因 GAPDH 荧光定量PCR扩增。 根据ΔΔCT 法计算检测基因反应条件为：37℃ 15 min，98℃ 5 min。后根据PCR试剂盒说明书进行PCR反应。获得数据以RQ=2-ΔΔCT计算mRNA表达量。H19的引物序列：3′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-5′，5′-UCUCAAACUAGUACCGAGUC-3′。

1.2.2细胞病毒感染 调节细胞至对数生长状态，细胞转染前36 h接种于24孔板培养，第2天细胞密度达到50%～80%融合状态。 将病毒置冰上融解后，按最佳MOI 值用培养液稀释，加入终浓度为5 ng/ml 的凝聚胺(Polybrene)，轻轻混匀后加入到细胞中，将H19-siRNA和阴性对照组转染细胞；按照Lipofectamine2000转染试剂盒说明书将miR-107-inhibitor和阴性对照转染细胞。在培养箱中孵育12 h 后换上完全培养基。病毒感染24 h后，荧光显微镜下观察荧光细胞。

1.2.3Transwell侵袭实验检测转染后肺癌细胞侵袭能力的影响 包被基底膜选择孔径为8 μm 的Transwel膜小室，培养基以1∶8 的比例稀释 50 ml/L Matrigel，来包被 Transwell 小室底部膜的上表面，放置于37℃聚合成凝胶。将细胞密度调整为1×106个/ml，向小室中加入500 μl含10% FBS的DMEM培养基，每孔注入5×103个细胞，放置于含 5%CO2的 37℃孵箱中培养12 h。用棉签轻轻擦去 Matrigel 基质胶和上室的细胞，利用0.1%结晶紫进行细胞染色2 min，PBS 缓冲液清洗2次，在倒置显微镜下观察并拍照。

1.2.4划痕实验检测转染细胞对后肺癌细胞迁移能力的影响 将细胞密度调整为5×105个/ml，接种到6孔板中，放置于5%CO2温箱孵育过夜，使细胞汇合度达到100%。细胞划痕先用Marker笔在每个孔的背面做好标记，以保证获取数据的位置保持一致。用灭过菌的枪头比着直尺，垂直于标记线快速进行划痕。并用PBS缓冲液反复冲洗细胞孔，将悬浮细胞去除。向培养孔加入不含血清的DMEM 培养基，放置于 5%CO2的 37℃孵箱孵育。 按照试验设计中的时间点取样，在显微镜下拍照。测量划痕的初始距离(0 h)；在24、48、72 h后，分别测量划痕的距离，并拍照，计算细胞的迁移率。

1.2.5荧光素酶活性检测 将荧光素酶报告载体与H19-siRNA共转染A549细胞。以转染pRL-TK作为标准内质控。转染36 h后，收获细胞。按Promega公司荧光素酶活性检测试剂盒说明书检测A549细胞荧光素酶活性。相对荧光素酶活性=萤火虫荧光素酶活性值/海肾荧光素酶活性值。

1.2.6裸鼠皮下成瘤观察miR-107对肿瘤生长的影响 裸鼠大小选自4～6周龄。建立裸鼠体内成瘤模型，取对数期生长的肺癌H19-siRNA细胞和H19-siRNA+miR-107-inhibitor组细胞。调整为细胞浓度为2×108ml-1。取0.1 ml细胞悬液注射于每只裸鼠左前肢腋窝皮下，共10只。注射后4周内，监控小鼠的存活率、体重和生存状态，测量刚死亡小鼠的肿瘤的尺寸、重量。

2 结果

2.1肺癌组织、癌旁组织中以及肺癌细胞中H19 mRNA的表达 qPCR结果表明：与癌旁组织相比，肺癌癌组织中H19 mRNA表达水平明显增高[(0.82±0.03) vs (0.17±0.02),P<0.05]，差异有统计学意义(图1A)；不同肺癌细胞中，A549细胞H19的表达水平最高(图1B)，结合以上结果，考虑H19在肺癌中起促癌作用，我们挑选A549为进一步实验细胞株。

2.2H19-siRNA对人肺癌细胞A549侵袭和迁移能力的影响 细胞侵袭穿过Matrigel的能力可以反映细胞的侵袭能力。图2A显示，使用H19-siRNA后，qPCR结果显示，H19-siRNA可以减少H19的mRNA水平。Transwell结果显示：NC组通过Matrigel基质胶的细胞数量为(179.2±7.4)，明显多于H19-siRNA组(44.8±2.9)， 差异有统计学意义(P<0.01)，见图2B。表明H19-siRNA可以抑制人肺癌细胞A549的侵袭能力。划痕实验结果表明：与NC组相比，在24、48、72 h时，H19-siRNA组迁移率明显降低[24 h (34.2±2.3)% vs (18.6±1.3)%,P<0.05; 48 h (62.8±4.8)% vs (39.9±3.1)%,P<0.05; 72 h (86.4±7.8)% vs (52.1±5.0)%,P<0.01]，差异有统计学意义(图2C)。表明H19-siRNA可以抑制人肺癌细胞A549的迁移能力。

2.3荧光素酶报告基因检测H19和miR-107的作用关系 qPCR结果表明：与癌旁组织相比，肺癌组织中miR-107 mRNA表达水平明显降低[(0.83±0.08) vs (0.21±0.02),P<0.05]，差异有统计学意义(图3A)；不同肺癌细胞中，A549细胞miR-107的表达水平表达最低(图3B)。

图1 qPCR检测肺癌组织和细胞中H19的mRNA表达水平Fig.1 qPCR detection of lung cancer tissue and cell H19 mRNA expression levelsNote: A.H19 expression in lung cancer tissues was higher than that in adjacent normal lung tissues；B.H19 had the highest expression level in lung cancer A549 cell line.*.P<0.05.

为明确与H19相关的miRNA的情况，我们使用生物信息学预测工具明确，H19可能与miR-107直接相互作用，为了验证H19能否与miR-107 3′UTR结合，我们将H19-siRNA与miR-107共转染到肺癌细胞A549中。荧光素酶报告基因结果显示(图3C、D)：加入了H19的荧光素酶可以减弱miR-107的荧光素酶的活性，表明H19可以和miR-107的相关靶点结合，明显增强miR-107的荧光素酶活性 。结果表明，H19能与miR-107的3′UTR特异性结合。2.4沉默H19后，miR-107对人肺癌细胞A549侵袭和迁移能力的影响 Transwell结果显示：H19-siRNA组通过Matrigel基质胶的细胞数量为(63.4±5.3)，明显少于H19-siRNA+miR-107-inhibitor组(206.4±6.9)，差异有统计学意义(P<0.01)，见图4A。表明沉默H19后，抑制miR-107可以促进人肺癌细胞A549的侵袭能力。划痕实验结果表明：与H19-siRNA组相比，在24、48、72 h时，H19-siRNA+miR-107-inhibitor组迁移率明显增高[24 h (46.3±5.3)% vs (24.1±3.2)%,P<0.05; 48 h (65.1±4.2)% vs (38.1±3.0)%,P<0.05;72 h (88.3±6.2)% vs (51.1±5.1)%,P<0.01]，差异有统计学意义，见图4B。表明沉默H19后，抑制miR-107可以促进人肺癌细胞A549的迁移能力。

2.5裸鼠皮下成瘤实验表明沉默H19后miR-107对肿瘤生长的影响 图5A 显示，沉默H19后，Notch信号通路的关键蛋白水平的表达出现相应的下调，表明H19的表达可能通过影响Notch信号通路的激活影响肺癌细胞的生物学行为。裸鼠肿瘤生长情况：与H19-siRNA组裸鼠肿瘤大小相比，H19-siRNA+miR-107-inhibitor组的肿瘤明显大于H19-siRNA组(图5B)。

图2 Transwell侵袭实验和划痕愈合实验检测H19对A549细胞株侵袭和迁移能力的影响Fig.2 Transwell invasion test and scratch healing test to detect effect of H19 on invasion and migration of A549 cell linesNote: A.H19-siRNA transfection efficiency level；B.Inhibition of H19 expression can attenuate the ability of A549 cells to attack;C.Inhibition of H19 expression can reduce the migration of A549 cells.*.P<0.05.

图3 miR-107在肺癌组织和细胞中的表达及H19对miR-107的调控关系Fig.3 Expression of miR-107 in lung cancer tissues and cells and regulation of H19 on miR-107Note: A.miR-107 expression in lung cancer tissues was lower than that in adjacent normal tissues；B.miR-107 had the lowest expression level in A549；C.Inhibited the expression of miR-107 after H19 expression was increased accordingly;D.H19 can regulate the expression activity of miR-107.*.P<0.05.

图4 Transwell侵袭实验和划痕愈合实验检测miR-107对A549细胞株侵袭和迁移能力的影响Fig.4 Effect of miR-107 on invasion and migration of A549 cells was detected by Transwell invasion assay and scratch healing testNote: A.Effect of miR-107 on the invasion ability of A549 cells were detected after silencing H19 by Transwell matrigel invasion assays；B.Effect of miR-107 on the A549 cells migration ability were detected after silencing H19 by wound healing assays.Error bars represent standard error.*.P<0.05.

图5 体内实验探讨沉默H19后miR-107对肿瘤生长的影响Fig.5 Effect of miR-107 on tumorigenesis after silencing H19 in vivoNote: A.Comparison of the tumor size of nude mice.B,C.Compare the volume and weight of the tumor in nude mice.*.P<0.05.

肿瘤重量和体积对比：与H19-siRNA组相比，H19-siRNA+miR-107-inhibitor组裸鼠肿瘤体积和重量都明显大于H19-siRNA组[体积(0.785±0.023)cm3vs (0.029±0.002) cm3，P<0.05；重量(2.952±0.125)g vs (0.312±0.043)g，P<0.05]，见图5C。

3 讨论

H19基因在人类基因群中广泛存在，可以干扰一些肿瘤的生物活性，比如肺癌、胶质瘤等[14,15]。Moulton等[16]认为，H19在肿瘤组织中表达水平受到明显的抑制 ，表明H19具有较强的抗肿瘤作用，甚至是肿瘤发展中的关键因子。然而，有另外一些研究报道，H19也有一定的促癌作用。Bartolomei等[17]检测了绒毛膜癌细胞株中H19的表达呈现较高水平，可能是诱导绒毛膜癌发展的基因。Zemel等[18]认为H19基因还是诊断膀胱癌是否复发的重要标志因子。Dey等[19]通过检测肺癌组织和正常肺组织中H19的表达，发现H19在肺癌组织中表达明显增高，并且是肺癌的一个独立预后因素。本研究通过检测肺癌患者肺癌组织和癌旁组织H19的表达发现，肺癌组织中H19的表达明显增高，结果与其他研究报道一致。

研究表明，H19的表达增高，可以导致多种肿瘤细胞的侵袭和迁移能力增强。Leighton等[20]研究表明，H19的表达水平与肺癌的分期有关，并且H19与肺癌浸润深度和转移范围呈一定相关关系。本研究通过沉默H19的表达，发现肺癌细胞的侵袭和迁移能力变弱，结合前面实验结果表明H19在肺癌的发生、发展过程中起重要作用。

本研究通过生物信息学分析证实，H19与miR-107有直接相互作用，进一步通过双荧光素酶报告基因证实，H19可与miR-107 3′UTR结合。miR-107在多种非典型增生组织中表达水平异常，并影响其侵袭和转移。有文献指出miR-107能够通过上调某些致癌基因或下调抑癌基因表达水平介导诸多肿瘤的发生[21]。Trivellin等[22]报道了miR-107参与结肠癌的血管生成。Sirotkin等[23]报道了miR-107参与了卵巢癌的细胞周期调控。然而在肺癌中miR-107表达情况及其作用还不清楚。本研究通过qPCR检测肺癌组织和癌旁组织miR-107的表达发现，miR-107在肺癌中表达明显下调，表明miR-107在肺癌中起抑癌作用。结合前面实验结果，通过沉默H19，抑制miR-107的表达来进一步研究miR-107在肺癌细胞侵袭和迁移过程中的作用。结果表明，沉默H19后，抑制miR-107的表达可以促进肺癌细胞的侵袭和迁移能力。裸鼠皮下成瘤的体内实验也有类似结果。

本研究通过使用qPCR检测H19和miR-107在肺癌和癌旁组织的表达，进一步探讨H19与miR-107的相互作用关系，研究H19与miR-107在肺癌细胞侵袭和迁移过程中的作用。研究表明H19在肺癌中表达上调，miR-107在肺癌中表达下调，H19与miR-107有直接相互作用。H19可以靶向通过miR-107调节肺癌的侵袭和迁移能力。H19可以调控Notch通路相关蛋白的表达，间接表明Notch信号通路在H19调控miR-107影响肺癌细胞生物学功能的过程中起到一定作用。提示H19和miR-107可能参与肺癌细胞侵袭、迁移过程，有可能成为预测肺癌进展、预后和监测治疗效果的标志物。

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[收稿2017-04-14 修回2017-05-17]

(编辑 张晓舟)

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Longnon-codingRNAH19promotedlungcancercellsmigrationandinvasionthroughmiR-107

LIJi-Yuan,ZHANGCan-Bin,MAXin,WANGQiang,WANGXian,ZHENGShuai-Yu.

DepartmentofThoracicSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofLuoyangUniversityofScienceandTechnology,Luoyang471000,China

Objective:To investigate the effect and the related mechanism of H19 on the invasion and migration ability of pancreatic cancer cells.Methods: The expression of H19 in tissues of pancreatic carcinoma and non-carcinoma adjacent tissues of pancreatic carcinoma were detected.qPCR was used to detect the expression of H19 in different pancreatic cancer cells.The migration and invasion ability of pancreatic cancer cells was detected after silencing H19 using wound healing assays and Transwell matrigel invasion assays.Dual-Luciferase Reporter Assay System was used to detect miR-107regulating H19.The expression of miR-107 in tissues of pancreatic carcinoma and non-carcinoma adjacent tissues of pancreatic carcinoma were detected.The regulation of miR-107 on the migration and invasion ability of pancreatic cancer cells were detected after silencing H19 using wound healing assays and Transwell matrigel invasion assays.Subcutaneous tumor was used to detect the size and volume of the tumor after inject the tumor cells.Immunohistochemistry was used to detect the expression of Ki67 and PCNA.Results: Compared with non-carcinoma adjacent tissues of pancreatic carcinoma,the expression of H19 of tissues of pancreatic carcinoma was significantly increased.The expression of H19 in pancreatic cancer cell A549 was highest.Silencing H19 could inhibit the migration of human pancreatic cancer A549 cells.miR-107 was the direct target of H19.Compared with non-carcinoma adjacent tissues of pancreatic carcinoma,the expression of H19 of tissues of pancreatic carcinoma was significantly decreased.After silencing H19,inhibiting the expression of miR107 could inhibit the migration of human pancreatic cancer A549 cells.Compared with the group of H19-siRNA,H19-siRNA+miR-107-inhibitor group mice tumor volume and weight were significantly bigger.Immunohistochemistry showed that compared with H19-siRNA group,the expression Ki67 and PCNA expression in H19-siRNA+miR-107-inhibitor group increased.Conclusion: H19 plays the role of tumor promotor factor in pancreatic cancer.H19 can affect the invasion and migration ability of pancreatic carcinoma cells by regulating miR-107.

H19；Pancreatic cancer；miR-107； Transwell

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.09.024

李纪远(1980年-)，男，硕士，主治医师，主要从事胸部肿瘤研究，E-mail：lijiyuan1006@126.com。

R734.2

A

1000-484X(2017)09-1392-05

①河南科技大学第一附属医院风湿科，洛阳471000。