黄芩素和U0126体外协同抗人膀胱癌细胞的作用及机制研究①

伍连春 陈杰翔 喻小兰 唐小平 王晓燕 张宇骄 夏纪毅

(内江市隆昌县中医医院泌尿外科，内江642150)

黄芩素和U0126体外协同抗人膀胱癌细胞的作用及机制研究①

伍连春 陈杰翔②喻小兰③唐小平④王晓燕④张宇骄⑤夏纪毅⑥

(内江市隆昌县中医医院泌尿外科，内江642150)

目的：探讨黄芩素和U0126体外协同抗人膀胱癌T-24细胞的作用及机制研究。方法：用黄芩素、U0126及二者联合处理T-24细胞，流式细胞术检测细胞周期、细胞凋亡；显微镜下计数细胞数量变化；TUNEL法检测细胞凋亡指数;实时定量PCR和Western blot分别检测T-24 细胞胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2) 、CyclinD1、GSK-3β和AKT RNA水平、蛋白水平，分析黄芩素与U0126对膀胱癌细胞凋亡和增殖的影响。结果：T-24细胞经不同浓度黄芩素处理后， 细胞凋亡率显著增加；T-24细胞经黄芩素处理24 h，G0/G1 期细胞比例明显增多，S 期细胞比例明显下降，细胞数减少，采用黄芩素联合U0126 处理T-24细胞24 h，S 期细胞比例显著降低;黄芩素或U0126单独处理T-24细胞引起明显细胞凋亡，二者联合处理凋亡更明显;利用两种药物单独或联合作用T-24细胞24 h，GSK-3β、ERK1/2、AKT磷酸化水平显著降低， ERK1/2、CyclinD1的 mRNA表达减少，联合处理作用更显著。结论：黄芩素和U0126 均可诱导T-24细胞凋亡，增加G0/G1 期细胞比例，降低S 期细胞比例，联合应用效果更明显。

黄芩素；U0126；膀胱癌；T-24；凋亡；胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)

膀胱癌的发病率居泌尿系统恶性肿瘤首位，占全身肿瘤的7%，其死亡率占全身肿瘤的3%，因此，研究抗膀胱癌的药物是具有挑战性的重点和热点课题。目前，临床上常用的化疗药物：甲氨蝶呤、多柔比星、顺铂、氟尿嘧啶等有一定疗效但副作用很大，因此，研发新型的治疗药物具有深远的临床意义[5]。而中药和小分子抑制剂联合使用在肿瘤靶向治疗方面有广阔的前景。膀胱癌的发生发展受到多种信号通路的调控，主要包括ERK1/2、AKT和GSK-3β等[1]。细胞外信号调节激酶(ERK)包括ERK1和ERK2两个亚型，其磷酸化是MAPK信号通路的关键步骤之一， 已有文献显示在黑色素瘤、结肠癌、卵巢癌、乳腺癌等肿瘤细胞中ERK1/2过度表达或活化与多种肿瘤细胞恶性转化息息相关[2]。AKT是PI3K信号通路下游的效应分子，抑制AKT表达或活性可阻断信号通路中多种肿瘤相关基因的活性，如生长因子/生长因子受体类癌基因、Ras癌基因、GSK-3β等[3]。GSK-3β是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，在癌症中起抑制作用，主要调节细胞的分化、增殖和凋亡等[4]。已有文献报道黄芩素在多种癌症中发挥抑制肿瘤细胞增殖迁移等功能，但其在治疗膀胱癌中的疗效还知之甚少[6]。U0126是高特异性的MEK1/2抑制剂，可降低ERK的磷酸化水平，影响细胞凋亡和增殖[7]。本研究主要探讨联合使用黄芩素和U0126在体外抗人膀胱癌细胞系T-24中的作用及机制。

1 资料与方法

1.1资料 人膀胱癌细胞系T-24购自于上海邦景实业有限公司，培养基为McCoy′s 5A Media (Modified with Tricine)，培养条件为37℃、5%CO2的培养箱。黄芩素由成都MUST科技有限公司提供，U0126及GAPDH购于碧云天生物科技公司，TUNEL试剂盒购于ROCHE公司，ERK1/2、CyclinD1、GSK-3β、AKT引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成，对应抗体均购于CST公司。

1.2方法

1.2.1流式细胞术检测黄芩素或U0126对T-24细胞周期的影响 人膀胱癌细胞系T-24接种于12孔板，处理后，收集细胞，室温PBS洗涤两次。采用BD公司周期检测试剂盒(Cat.No.340242)，每个样本用1 ml Buffer solution 离心洗涤1次，加入250 μl solution A 重悬细胞沉淀，室温反应10 min；加入200 μl solution B并轻轻混匀，室温反应 10 min；加入200 μl solution C 轻轻混匀后置于2～8℃避光染色10 min。流式上样分析，用488 nm激发光检测PI 荧光。结果采用细胞周期拟合软件进行分析，记录G0/G1期、S期、G2/M期细胞比例，实验重复3次。

1.2.2显微镜观察黄芩素对T-24数量的影响 采用0、2、5、10和20 μmol/L黄芩素处理人膀胱癌细胞株T-24细胞24 h后，低倍镜下计数细胞数量。

1.2.3TUNEL法检测黄芩素及U0126对T-24凋亡的影响 细胞经处理后，移去培养基，利用4%PFA固定，PBS漂洗两遍，3%H2O2浸泡和蛋白酶室温孵育，室温湿盒中加入TUNEL试剂，60 min，PBS洗3遍，加convert-POD，室温30 min，常规加入DAB，苏木素，封片，观察并照相分析结果。

1.2.4Real Time PCR检测黄芩素及U0126对T-24细胞凋亡相关基因表达水平的影响 人膀胱癌细胞株T-24分别用20 μmol/L黄芩素以及10 μmol/L U0126单独或联合处理24 h后，去掉培养基，收集沉淀，无菌PBS洗两遍，用Trizol提取总RNA，采用Thermo Fermentas公司生产的反转录试剂盒分析相关基因的表达水平。引物序列由基因公司设计合成。各种基因的相对表达量利用用2-ΔΔCt法对进行分析。

1.2.5流式细胞术检测细胞凋亡 人膀胱癌细胞系分别用20 μmol/L黄芩素以及10 μmol/L U0126单独或联合处理24 h后，收集细胞，PBS洗两次。采用BD公司细胞凋亡检测试剂盒(Cat.No.556547)，利用1 ml 结合缓冲液离心洗涤细胞，弃去上清后，在100 μl细胞悬液中分别加入Annexin V-FITC和PI染色液各5 μl，避光，室温孵育15 min。加入400 μl 1×Binding Buffer重悬细胞，流式上样检测并分析细胞早期凋亡率和晚期凋亡率，实验重复3次。

1.2.6Western blot检测黄芩素或U0126对人膀胱癌细胞系T-24增殖相关蛋白的影响 处理T-24细胞后，用4℃预冷的PBS冲洗细胞两次，离心去上清加入含5%蛋白酶抑制剂的裂解液(RIPA强)，冰上裂解20 min，15 000 r/min离心5 min，超声，在95℃金属浴中变性、-20℃冻存。取5 μl蛋白依次进行电泳，浓度为10%SDS-PAGE，并PVDF转膜，封闭，PBS漂洗后，分别加入不同比例的一抗，4℃孵育过夜。(P-ERK1/2稀释比例为1∶1 000，CyclinD1稀释比例为1∶500，P-AKT稀释比例为1∶1 000，P-GSK-3β稀释比例为1∶1 000，GAPDH稀释比例为1∶2 000)，1×TBST漂洗，加入1∶2 000稀释的HRP标记羊抗小鼠IgG(H+L)及HRP标记羊抗兔IgG(H+L)，在室温环境中孵育1 h，1×TBST漂洗，凝胶成像仪和Quantity one分别照相并进行灰度分析。

2 结果

2.1黄芩素联合U0126可显著抑制T-24细胞增殖 20 μmol/L黄芩素作用于人膀胱癌细胞系T-24细胞24 h后，与空白或DMSO对照组比较，细胞比例在S期下降，而在G0～G1期增多(P<0.05)，但G2/M期无显著改变(P>0.05)，将黄芩素和U0126联合对T-24细胞作用24 h后，细胞比例在S期降低更加明显(P<0.05),G2/M期仍未有显著改变(P>0.05)。结果表明，黄芩素降低人膀胱癌T-24细胞系S期作用显著，而黄芩素和U0126联合使用降低S期细胞的比例更加明显(图1A、B)。

2.2黄芩素可促进T-24细胞凋亡 与空白对照组和DMSO组相比，T-24细胞经2、5、10和20 μmol/L黄芩素处理24 h后，细胞数量减少越来越明显(P<0.05)。此研究结果表明，随着黄芩素浓度升高，人膀胱癌细胞系T-24细胞数量逐渐减少(图2)。

2.3黄芩素联合U0126可诱导人膀胱癌细胞系T-24凋亡 20 μmol/L黄芩素作用于人膀胱癌细胞系T-24细胞24 h后，与空白或DMSO对照组比较，细胞凋亡现象显著(P<0.05)，而黄芩素和 U0126联合使用对T-24细胞凋亡的促进作用更显著(P<0.05)。该结果提示将黄芩素和U0126联合应用，可协同诱导细胞凋亡(图3A、B)。20 μmol/L黄芩素作用于人膀胱癌细胞系T-24细胞24 h后，与空白或DMSO对照组比较，可促进早期和晚期凋亡率，而黄芩素与U0126联合作用诱导T-24细胞的早期和晚期凋亡更加明显(P<0.05)。该结果提示黄芩素和U0126联合应用诱导T-24细胞凋亡的作用更明显(图3C、D)。

2.4黄芩素或U0126抑制T-24细胞ERK1/2、CyclinD1、GSK-3β和AKT表达 利用黄芩素或U0126单独或联合作用T-24细胞24 h后，可下调ERK1/2、CyclinD1、mRNA表达(P<0.05)。此研究结果表明，黄芩素和U0126均可诱导人膀胱癌细胞系T-24细胞凋亡(图4A)。T-24细胞经20 μmol/L黄芩素或10 μmol/L U0126单独处理24 h后，与空白对照组和DMSO组相比，可下调GSK-3β、ERK1/2以及AKT磷酸化水平(P<0.05)，CyclinD1蛋白表达量显著降低(P<0.05)，二者联合作用对T-24细胞增殖和凋亡因子改变作用更强(P<0. 05)。 该结果说明黄芩素和U0126都可以促进人膀胱癌细胞系T-24细胞凋亡，抑制细胞增殖，且二者具有协同效应(图4B)。

图1 黄芩素联合U0126对T-24细胞周期影响Fig.1 Effects of baicalein combined with U0126 on cell cycle of T-24 cellsNote: A.Flow cytometry to detect the effect of baicalein or U0126 on cell cycle of human bladder cancer cell line T-24;B.Semi-quantitative analysis of cell cycle distribution.*.P<0.05.

图2 黄芩素诱导T-24细胞凋亡减少Fig.2 Effect of Baicalin on the number of T-24 cells in human bladder cancer cell lineNote: *.P<0.05.

图3 黄芩素联合U0126对T-24细胞凋亡Fig.3 Effect of baicalein combined with U0126 on T-24 cell apoptosisNote: A.TUNEL method used to detect the effect of baicalein or U0126 on apoptosis of human bladder cancer cell line T-24;B.Apoptosis index (AI%) Statistical analysis;C.Human bladder cancer cell line T-24 in baicalein or U0126 early or combined with early/late apoptotic changes;D.Human bladder cancer cell line T-24 in baicalein or U0126 alone or in combination early / late apoptotic analysiss.*.P<0.05.

图4 黄芩素与U0126体外抗膀胱癌分子机制研究Fig.4 Molecular mechanism of baicalein combined with U0126 on bladder cellsNote: A.Real Time PCR detection of baicalein and U0126 inhibition of T-24 cells ERK1/2,CyclinD1; B.WB was used to detect the effect of baicalein or U0126 on ERK1/2,CyclinD1,GSK-3β and AKT protein in T-24 cells.*.P<0.05.

3 讨论

膀胱癌是泌尿外科最常见的恶性肿瘤之一，近年来发病率和致死率逐年升高。膀胱癌的治疗一般以肿瘤细胞信号转导通路为靶点，如ERK1/2、AKT和GSK-3β等[8]。目前针对膀胱癌的化疗虽然有一定的临床疗效，但不良反应大、化疗不敏感和抗药性等问题尚未解决[9]。而中药和小分子抑制剂联合使用在肿瘤靶向治疗方面有广阔的前景。因此，本文探究了中药黄芩素与小分子抑制剂U0126联合治疗膀胱癌的作用及分子机制。

根据文献报道，黄芩素是中药黄芩中的活性分子，可抑制癌细胞增殖，诱导癌细胞凋亡，是具有吸引力和前景的中药[10]。U0126作为MAPK激酶的抑制剂，通过特异性抑制ERK信号通路活性诱导细胞凋亡，U0126还可以通过调控AP-1转录活性，抑制激活MAP激酶p42和p44[11，12]。已有多篇文章报道，U0126可用于治疗多种癌症。我们本研究的结果显示：联合使用黄芩素和U0126比单独使用黄芩素抑制膀胱癌细胞增殖的作用更加明显。黄芩素和U0126通过阻止宫颈癌细胞G1期细胞向S期细胞转化，达到协同抑制细胞增殖的效果。因此，黄芩素与U0126联合使用时，显著抑制膀胱癌的增殖，同时诱导膀胱癌细胞的凋亡。

我们的实验结果表明：黄芩素与U0126联合使用有更强的膀胱癌抑制效果，但其具体的分子机制尚不清楚。ERK1/2/MAPK信号通路在膀胱癌的发生发展中起着重要作用，其异常活化可导致癌细胞丧失凋亡和分化的能力，促进癌细胞恶性转化，异常增殖[13]。因此，阻断该信号通路对于治疗膀胱癌具有重大的意义。ERK1/2/MAPK信号通路有三个关键分子：Ras、Raf和MEK[14]，我们前期的研究表明，黄芩素可有效降低ERK1/2蛋白的磷酸化水平，从而起到抑制宫颈癌细胞增殖的作用[15,16]。本研究中使用黄芩素联合U0126处理人膀胱癌细胞系T-24，结果显示ERK1/2的表达量和磷酸化水平急剧降低，可有效抑制癌细胞增殖，促进凋亡。

AKT是PI3K/AKT信号通路中的关键分子，在多种信号通路中起着枢纽作用，参与多种癌症的发生发展和转移，维持癌细胞的恶性生物学特征[17]。癌细胞在诸多内外因素的刺激下，诱导激活PI3K/AKT信号通路，促进细胞增殖和分化。抑制AKT的表达和磷酸化，可通过多种癌基因直接或间接实现，如生长因子癌基因、生长因子受体癌基因、Ras癌基因以及CyclinD1等癌基因的表达，从而阻断AKT的致癌作用[18]。多篇文献报道显示；AKT在多种癌症组织中均存在过度表达或过度活化，如肺癌、前列腺癌、乳腺癌等[19]。本研究表明，联合使用黄芩素和U0126处理T-24细胞时，AKT蛋白的磷酸化水平显著低于黄芩素或U0126单独处理的人膀胱癌T-24细胞系。同时，黄芩素与U0126联合使用时，CyclinD1的mRNA和蛋白水平在T-24细胞中显著降低，从而使T-24细胞周期阻滞在G0/G1期抑制膀胱癌细胞的增殖。

AKT信号通路中的重要信号分子；GSK-3β蛋白的磷酸化水平，对细胞增殖、凋亡发挥重要的调控作用[20]。已有文献报道，抑制GSK-3β磷酸化后可抑制肝癌细胞增殖，并调控相关细胞增殖、凋亡通路[21]。本研究中使用黄芩素和U0126处理T-24细胞系，GSK-3β的磷酸化水平均显著降低，从而抑制膀胱癌细胞的增殖，促进膀胱癌细胞凋亡。综上，本文研究表明黄芩素与U0126联合使用处理膀胱癌细胞T-24细胞通过降低ERK1/2、AKT、GSK-3β等蛋白的磷酸化水平，抑制ERK1/2和CyclinD1蛋白的表达水平，进而抑制膀胱癌细胞的增殖并促进细胞的凋亡。根据以上研究数据，我们推测AKT是黄芩素和U0126治疗膀胱癌的潜在分子靶点，因此，临床上我们可以将这些分子作为治疗靶点利用多种手段使其失活可达到治疗膀胱癌的目的。

综上所述，黄芩素联合U0126 处理膀胱癌细胞通过抑制ERK1/2信号通路，诱导T-24细胞凋亡，增加G0/G1 期细胞比例，降低S 期细胞比例的作用显著，因此黄芩素和U0126联合应用为临床治疗膀胱癌的化疗方案提供了新的参考依据。

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[收稿2017-03-22 修回2017-05-24]

(编辑 倪 鹏)

RoleofBaicaleincombinedwithU0126resistinghumanbladdercarcinomacellinvitroandmechanismresearch

WULian-Chun,CHENJie-Xiang,YUXiao-Lan,TANGXiao-Ping,WANGXiao-Yan,ZHANGYu-Jiao,XIAJi-Yi.

DepartmentofUrology，theTCMHospitalofLongchang，Neijiang642150,China

Objective:To investigate the role of Baicalein combined with U0126 resisting human bladder cancer T-24 cells in vitro and mechanism.Methods: T-24 cells were dealt with Baicalein combined with U0126,flow cytometry was used to detect cell cycle and cell apoptosis,microscope to count cell number,TUNEL method to detects cell apoptosis index,and Real time quantitative PCR and Western blot to measure extracellular signal regulating kinase 1/2 (ERK1/2), CyclinD1, GSK-3β and AKT RNA level, protein level of T-24 cells respectively.Effect of Baicalein and U0126 on apoptosis and proliferation of bladder cancer cell was analyzed.Results: Cell apoptosis rate was significantly increased after T-24 cells dealt with various concentrations of Baicalein.Cell proportion of G0/G1 phase was significantly increased,while cell percentage of S phase was obviously decreased and cell count was decreased,after T-24 cells were dealt with Baicalein for 24 h.After T-24 cells were dealt with Baicalein combined with U0126 for 24 h,cell proportion of S phase was evidently decreased.T-24 cells were dealt with Baicalein or U0126 obviously promoted cell apoptosis,which was more obvious with Baicalein combined with U0126.Phosphorylation level of GSK-3β,ERK1/2,and AKT was significantly reduced and expression of ERK1/2 and CyclinD1 mRNA was evidently lower after Baicalein or U0126 or Baicalein combined with U0126,and combined application had more remarkable effect.Conclusion: Baicalein and U0126 can induce apoptosis of T-24 cells,increase cell proportion in G0/G1 phase,reduce cell proportion of S phase,and Baicalein combined with U0126 effect has more remarkable effect.

Baicalein；U0126；Bladder cancer；T-24；Apoptosis；Extracellular signal regulating kinase 1/2

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.09.012

伍连春(1979年-)，男，硕士，主治医师，主要从事泌尿系统肿瘤机制的研究。

及指导教师：夏纪毅(1979年-)，男，硕士，高级实验师，主要从事肿瘤机制方面研究。

R73

A

1000-484X(2017)09-1336-05

①本文为四川省科技厅项目(14JC01353-LH67)和四川省泸州市科技局项目(2014-S-44)。

②西南医科大学附属医院泌尿外科，泸州646000。

③西南医科大学附属中医医院妇产科，泸州646000。

④西南医科大学附属医院医学实验中心，泸州646000。

⑤西南医科大学附属医院妇产科，泸州646000。

⑥西南医科大学医学信息和工程学院，泸州646000。