miR-218调控SNX4蛋白对乳腺癌细胞增殖和侵袭的影响①

张建波 宋 魏 王媛媛 刘明阁 孙淼淼

(郑州大学附属肿瘤医院病理科，郑州450008)

·生物治疗·

miR-218调控SNX4蛋白对乳腺癌细胞增殖和侵袭的影响①

张建波 宋 魏 王媛媛 刘明阁 孙淼淼

(郑州大学附属肿瘤医院病理科，郑州450008)

目的：探讨miR-218调控SNX4蛋白对乳腺癌细胞增殖和侵袭能力的影响。方法：qPCR检测乳腺癌组织和乳腺癌细胞株中miR-218的表达情况；分析miR-218的表达和乳腺癌临床病理参数之间的关系；双荧光素酶实验检测miR-218和SNX4之间的关系；过表达miR-218后MTT实验和侵袭实验检测乳腺癌细胞增殖和侵袭能力变化；过表达SNX4后MTT实验和侵袭实验检测SNX4对乳腺癌细胞增殖和侵袭能力的恢复水平；裸鼠体外成瘤实验检测miR-218对乳腺癌细胞株成瘤能力的影响。结果：miR-218在乳腺癌组织和MCF-7细胞株中表达水平较高，miR-218的表达与乳腺癌的病理分期相关以及淋巴结转移情况有关， SNX4可能是miR-218下游的作用靶点；过表达miR-21可以抑制乳腺癌细胞的增殖侵袭能力，过表达SNX4后可以逆转miR-218对乳腺癌细胞的抑制作用，过表达miR-218后可以抑制乳腺癌细胞株在裸鼠体内的成瘤能力。结论：miR-218在乳腺癌中表达上调，同时miR-218可以调控SNX4的表达而影响乳腺癌细胞增殖和侵袭能力。

乳腺癌；miR-218；SNX4；侵袭

乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率仅次于卵巢癌和宫颈癌[1]。乳腺癌也是女性死于癌症的第二大原因，仅次于肺癌[2]。乳腺癌根据基因表达可分为两类：一类乳腺癌是过表达人类表皮生长因子受体2(HER2/ErbB2)，一类是HER2/ErbB2表达阴性，前者的预后相比后者较好[3]。而目前研究探明乳腺肿瘤包含癌细胞和癌细胞相通的基质细胞，如免疫、间充质和血管细胞，癌细胞和其基质细胞之间的联系是由生长因子、细胞因子、蛋白酶和细胞外基质蛋白等介质介导的[4]。这些细胞外因子与基质细胞一起构成肿瘤微环境。然而，目前还不清楚这些因子对乳腺癌发生和发展进程中的具体作用，所以探讨乳腺癌新的分子生物学靶标是目前的研究重点。

目前分子生物学的进展对乳腺癌的早期诊断和治疗已经提供了很大的帮助。然而，对于晚期广泛侵袭和转移的乳腺癌的治疗仍然效果不佳[5]。针对乳腺癌细胞的转移机制还没有完全阐明。最近很多研究都表明，微核糖核酸(microRNAs或miRNAs)涉及多种类型肿瘤的转移和侵袭过程，包括miR-10b、miR-21、miR-126、miR-335、miR-373、miR146、miR-218和miR-205[6]。其中miR-224和miR-21和前列腺癌相关[7]。miR-29c和鼻咽癌相关[8]。 miR-10a、miR-222、miR-125b、miR-7和miR-452和膀胱上皮癌相关[9]。然而，目前报道的参与乳腺癌转移的miRNA相对较少。

Sorting nexins (SNXs) 是一类含有PX结构域的分子蛋白，在细胞内蛋白分选和蛋白运输等过程中发挥关键作用[10]。PX结构可以与磷脂酰肌醇集团特异性结合，并影响相关细胞器的活性[11]。根据结构域组成，目前在哺乳动物中发现有33种SNXs，包括SNX3、SNX4、SNX10、SNX12、SNX22和SNX-PX-BAR等[12]。在SNXs家族蛋白中，SNX-PX-BAR的功能研究报道较多，可以调控在细胞体内分选运输过程。SNX4参与调节转铁蛋白受体的循环转运过程[13]。最近，有学者研究SNX4对肝细胞的生物学功能的影响，发现过表达SNX4状态可以对抗肝脏细胞中抗凋亡蛋白的表达。

本文实验通过检测miR-218和SNX4在乳腺癌细胞中的表达及相关作用，根据细胞生物学行为实验，推测miR-218对乳腺癌细胞的影响情况及和SNX4的相关机制，为乳腺癌的发展过程中的分子机制提出新的可能。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞株和裸鼠标本 人类乳腺癌细胞MDA-MB-468、MDA-MB-435、MDA-MB-231、SKBR3、MCF-7购自上海细胞库。细胞饲养条件：10%胎牛血清，100 U/ml青霉素钠和100 mg/ml链霉素的RPMI1640培养基(Gibco，Carlsbad，CA，USA)，在含有5%CO2的37℃恒温箱中孵育。所有患者样本均获得书面知情同意书。动物实验经动物研究机构委员会批准并符合国家实验动物护理和使用指南。

1.1.2抗体和试剂 SNX4兔单克隆抗体均购自Abcam(ab118556)。Transwell小室购自美国Millipore公司。Matrigel购自美国BD公司。SNX4沉默及对照慢病毒购自上海吉凯制药技术有限公司。qPCR引物以及RNA提取试剂盒、PCR试剂盒均购自广州复能基因有限公司。miR-218-mimic购自上海吉凯制药技术有限公司。Transwell小室购自美国Millipore公司。PCR试剂盒均购自广州复能基因有限公司。

1.2方法

1.2.1双荧光素酶报告基因 为进一步确证miR-218能够靶向作用于SNX4。本实验将SNX4的3′UTR区构建入荧光素酶报告基因载体。本次所用的双荧光素酶报告基因实验的载体包含两个荧光素酶报告基因：一个是海肾荧光素酶报告基因，一个是荧火虫荧光素酶报告基因，后者作为内对照。将上述基因的3′UTR构建到海肾荧光素酶报告基因的直接下游区，如果3′UTR能够被miR-218识别，则该3′UTR前面的基因Luciferase的表达将被抑制，所以它与内参之间的比例会发生变化。

1.2.2MTT增殖实验 体外增殖实验测定使用24孔板(8 mm孔径)测量乳腺癌细胞系的增殖能力。 将对数期乳腺癌细胞使用胰蛋白酶消化后，制成单细胞悬浮液并以1×103细胞/孔的密度接种到24孔板中。 在细胞培养7 d后，加入20 μl MTT测定液，每孔充分混合均匀，并在37℃下孵育4～6 h。然后使用无菌吸管吸出上清液，每孔加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，在室温下搅拌10 min保证晶体充分溶解。然后在24、48、72和96 h MTT测定波长为490 nm时的吸光度，计算乳腺癌细胞的增殖情况。实验重复3次。

1.2.3Transwell侵袭实验 所有试剂及器材均于冰上预冷，将Transwell小室置于24孔板内，将Transwell小室内膜均匀涂抹Matrigel胶 50 μl (0.2 μg/μl)，37孵育15 min，至胶凝固后，消化、离心、计数卵巢癌细胞后，按照2.5×104ml-1用无血清培养基稀释细胞，制成细胞悬液；按照每孔200 μl，将细胞悬液加入Transwell上室，同时在Transwell下室加入10%FBS+培养基500 μl，放入37℃孵箱培养；甲醛固定，结晶紫染色10 min，然后用棉签轻轻擦拭内膜上的细胞。显微镜下计数，计数4个高倍视野(×40)下穿过滤膜的细胞数。实验重复3次。

1.2.4裸鼠体内实验 取对数期生长的乳腺癌细胞，分为两组。消化后重悬待用，调整为细胞浓度为2×107ml-1。取0.1 ml细胞悬液注射于每只裸鼠腹腔中，每组5只。之后每日观察裸鼠皮下肿瘤生长情况。接种2周后，肉眼可见肿瘤生长。隔天测量各组荷瘤小鼠肿瘤直径(a)和垂直正交径(b)。6周后处死裸鼠，剥除瘤体测量并计算。

1.3统计学分析 统计分析均采用SPSS 16.0软件包进行。用Student′st检验或χ2检验确定差异的统计学意义吗，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1miR-218在乳腺癌组织和细胞中的表达情况 使用qPCR检测70例乳腺癌患者和邻近正常乳腺组织中miR-218的表达情况。 结果表明(图1A)，与相邻正常乳腺组织相比，miR-218的表达在乳腺癌组织中明显下调。在不同乳腺癌细胞株中，与MDA-MB-468、MDA-MB-435、SKBR3、MDA-MB-231相比，MCF-7细胞株中观察到miR-218表达相对较低，而且MCF-7的侵袭性相对较强(图1B)。因此，我们选择了MCF-7细胞株进行后续研究。

2.2miR-218与乳腺癌标本临床病理参数之间的关系 为了证实miR-218在乳腺癌组织标本中的表达与其病理参数之间关系。70例乳腺癌肿瘤组织样本类型为导管内癌(55例)、小叶原位癌(10例)，乳头状癌(5例)。在不同病理类型的乳腺癌之间的表达差异不明显，无统计学意义(P>0.05)。miR-218的表达与年龄、无明显统计学差异(P>0.05，表1)。miR-218的表达与乳腺癌的病理分期以及淋巴结转移情况有关，随着分期越低，miR-218在乳腺癌组织中表达也越高(P<0.05，表1)。

图1 miR-218在乳腺癌组织和细胞中的表达情况Fig.1 Expression of miR-218 in breast cancer tissues and cell lines

表1miR-218表达与乳腺癌临床病理特征的关系

Tab.1miR-218expressionandrelationshipbetweenclinicopathologicalfeaturesofbreastcancer

Clinicopathol-ogicaldataNumberHighexpressionofmiR-218LowexpressionofmiR-218PvalueYears0.669≤6039211860312011Pathologicalstaging0.010Ⅰ15312Ⅱ1266Ⅲ37928Ⅳ615Lymphnodemetastasis0.008No451233Yes25718

2.3miR-218与SNX4之间的相关关联 为了寻找miR-218的下游靶点，我们利用生物信息学分析，发现miR-218的序列与下游SNX4基因的部分序列有相同的结合位点。为了验证二者之间是否有调节关系，我们进行双荧光素酶标记实验。首先我们构建了SNX4携带3′-UTR的荧光素酶报告因子，其中每个基因的结合位点与miR-218结合位点相对应。双荧光素酶实验测定显示miR-218可以与下游SNX4的3′UTR位点相结合，而不是其他靶点基因，沉默miR-218后可以导致SNX4的荧光素酶活性显著降低(图2B)。沉默miR-218后可明显下调MCF-7细胞中SNX4的表达。上述结果表明miR-218可以调控下游SNX4蛋白表达情况，可能是通过调控SNX4的表达影响乳腺癌细胞株的生物学行为。

2.4miR-218对乳腺癌细胞增殖和侵袭能力的影响 为了研究miR-218对乳腺癌细胞增殖和侵袭能力的影响，使用MCF-7细胞株进行质粒转染以增加miR-218的表达。通过MTT实验检测miR-218对MCF-7细胞增殖情况的影响。miR-218-mimic组的细胞的生长速度比对照组明显降低[(23.4±2.2)% vs (86.45±5.1)%,P<0.01]，培养96 h后抑制效果显示具有统计学意义。如图3所示，Transwell侵袭实验检测miR-218对MCF-7细胞侵袭情况的影响。miR-218-mimic组的细胞的侵袭细胞数目比对照组明显增多[(186.5±15.1)% vs(48.4±4.2)%,P<0.01]，差异具有统计学意义(图3，P<0.05)。综上所述，过表达miR-218后可以明显抑制MCF-7乳腺细胞株的增殖和侵袭能力。

图2 双荧光素酶实验检测miR-218与SNX4之间的相关关联Fig.2 Double luciferase assay to detect association between miR-218 and SNX4Note: *.P<0.05.

图3 miR-218对乳腺癌细胞增殖和侵袭能力的影响Fig.3 Effects of miR-218 on proliferation and invasion of breast cancer cellsNote: A.MTT assay for the effect of miR-218 on proliferation of breast cancer cells；B.Transwell migration and invasion assay were used to detect the effect of miR-218 on the invasive ability of breast cancer cells.*.P<0.05.

图4 SNX4和miR-218对乳腺癌细胞增殖和侵袭能力的影响Fig.4 Effects of SNX4 and miR-218 on proliferation and invasion of breast cancer cellsNote: A.Effect of MTT assay on the proliferation of breast cancer cells；B.Transwell migration and invasion assay to detect the effect of SNX4 on the invasive ability of breast cancer cells.

图5 miR-218对乳腺癌细胞体外成瘤能力的影响Fig.5 Effect of miR-218 on tumorigenic ability of breast cancer cells in nude miceNote: A.Effects of miR-218 on tumorigenic ability of breast cancer cells in nude mice；B.Nude mice tumor volume and quality comparison

2.5SNX4对乳腺癌细胞增殖和侵袭能力的逆转作用 如上述实验所示，过表达miR-218乳腺癌细胞株增殖和侵袭能力受到抑制，然后我们在miR-218-mimic组细胞中过表达SNX4蛋白，观察乳腺癌细胞株的增殖和侵袭能力是否能被逆转。实验结果显示(图4)，与miR-218-mimic组相比，miR-218-mimic+LV5-SNX4组乳腺癌细胞的生长速度显著增快；miR-218-mimic+LV5-SNX4组乳腺细胞株的细胞侵袭数目明显多于miR-218-mimic组[(146.5±12.8)% vs (44.7±3.1)%]，差异具有统计学意义(P<0.05)。我们可以得到结论，在乳腺癌细胞株中过表达SNX4蛋白可以逆转miR-218对其的抑制能力，也侧面说明了miR-218和SNX4之间有相互调控的关系。

2.6miR-218对乳腺癌细胞裸鼠体外成瘤能力的影响 裸鼠肿瘤生长情况(图5A)：与NC组裸鼠比较，miR-218-mimic组的肿瘤明显缩小，肿瘤重量和体积对比如(图5B、C)：与NC组相比，miR-218-mimi组裸鼠肿瘤体积和重量都明显缩小[体积(2.65±0.32)cm3vs (0.98±0.12) cm3，P<0.05；重量(2.18±0.27)g vs (0.97±0.13)g，P<0.05]。表明过表达miR-218后，可以抑制人乳腺癌细胞MCF-7的肿瘤生长能力。

3 讨论

在肿瘤学研究过程中，建立一个理想的荷瘤模型是至关重要的步骤[14]。在本研究中，我们通过筛选高侵袭潜力的乳腺癌细胞系MCF-7，然后构建乳腺癌的体内体外模型，根据生物学行为实验验证我们对miR-218和SNX4的关系推测。这是我们实验得到正确实验结果的关键步骤。

miRNA是天然存在的一种短序列的非编码RNA分子，负责调节基因表达和转录[15]。在哺乳动物中，成熟miRNA通过复杂的连续加工过程从pri-miRNA和pre-miRNAs中产生，广泛存在于许多生物体中[16]。miRNA一般是由21～24个核苷酸组成，通过与下游靶点形成复合物，来抑制翻译过程或诱导靶向mRNA的降解来起作用[17]。新的证据表明，miRNA在各种生物过程中起关键作用，包括细胞分化、增殖、凋亡、应激反应、脂肪代谢、肿瘤发生和转移等[18-20]。最近报道，miRNA在多种类型的肿瘤中可以促进或抑制恶性肿瘤细胞的转移侵袭，为研究肿瘤细胞转移的过程提供了新的视角。尽管如此，miRNA在乳腺癌转移过程中的作用还尚未被研究清楚。在本报告中，我们选择出高侵袭性的MCF-7的乳腺癌细胞，建立优良的乳腺癌细胞转移模型进行后续实验探索。

虽然在几种类型的实体瘤中已报道了miR-218水平存在一定的表达异常，但是不包括乳腺癌，在乳腺癌中miR-218的表达异常及其作用机制尚未被揭示[21,22]。但是我们可以肯定的是miR-218的下调肯定是与肿瘤发生发展相关。在本研究中，我们着重研究miR-218对乳腺癌增殖和侵袭的影响，并证明miR218可能作为乳腺癌转移的肿瘤抑制因子。 miR-218的表达下调一定程度上促进肿瘤细胞生长和侵袭行为，甚至影响裸鼠体内肿瘤的生长。

然而对于miR-218是直接影响乳腺癌细胞的行为还是作为上游调控因子起作用，我们进行深一步的研究，通过生物信息学的查阅推测，miR-218和下游SNX4蛋白有相似的结合位点。在之前的研究中，有学者报道SNX4通常在各种侵袭性细胞株中表达水平增高，在非侵袭性细胞中表达水平较低，表示SNX4可能扮演一个促癌因子的作用，而miR-218则在乳腺癌细胞株中恰好表现出相反的表达模式。当我们转染miR-218-mimic后，可以抑制乳腺癌细胞恶性生物学行为的进展，然而在继续过表达SNX4后，我们观察到乳腺癌细胞的增殖和侵袭行为在一定程度上得到恢复，即SNX4的高表达可以对抗miR-218对乳腺癌细胞行为的抑制。通过双荧光素酶实验我们也进一步证实了该结果，miR-218可以调控SNX4的表达水平。有研究报道，SNX4和miR-218都对肿瘤细胞的侵袭具有一定的抑制影响，但是通过敲除SNX4的效应较弱，这可能是因为SNX4不是miR-218相关的唯一靶标。这些表明miR-218对细胞侵袭的抑制作用至少部分通过调控SNX4的表达来介导的[23]。而且SNX4受体对于细胞外信号和细胞表型变化都有一定的适应性，因此，miR-218对SNX4蛋白的调节可能有助于细胞内外的信号转导[24]。据报道，抗SNX4单克隆抗体在小鼠中是对抗肿瘤细胞的有效治疗方式[25]。与以往研究结果一致，我们发现miR-218与SNX4相互作用，对乳腺癌细胞的迁移和侵袭进行调控。

之前有学者使用miRNA微阵列检查不同组织及细胞系中的整体miRNA表达谱，以鉴定与人类乳腺侵袭相关的差异表达的miRNA的情况。总共检测出45个miRNA表达在侵袭性乳腺癌细胞中存在差异表达的情况[26]。其中miR-218在高侵袭性乳腺癌细胞中明显下调，与乳腺癌患者肿瘤的发生和转移密切相关[27]。最近，在几种实体瘤(包括前列腺癌、乳腺癌、肺癌和宫颈癌)中均报道了存在miR-218表达下调的情况[28-30]，但是miRNA-218仅仅被检测在肿瘤组织中存在异常表达情况，没有进行深一步的研究来评估miR-218在肿瘤转移中的意义。在这里，我们统计发现miR-218表达降低与晚期临床分期、淋巴结转移和患者预后相关。同时使用生物信息学搜索miR-218靶标，我们将SNX4蛋白定位为miR-218的功能靶标，我们证实miR-218和SNX4之间的相互作用对于乳腺癌细胞的迁移和侵袭是至关重要的。因此，我们继续探讨miR-218和SNX4之间的关系，力图发现miR-218对乳腺癌细胞影响的分子途径，确定miR-218是如何促进乳腺癌细胞增殖和侵袭行为的。我们的研究结果不仅为乳腺癌的转移机制提供了新的见解，而且还揭示了一种新的信号调节机制。

总之，我们确定了在高侵袭性乳腺癌细胞中，异常表达的miR-218的下调可以促进乳腺癌细胞的增殖和侵袭，且可以被SNX4负调控。该结果表明，miR-218/SNX4的通路可能是未来治疗乳腺癌的合理治疗策略。当然本研究还有不完善之处，可以继续探讨其他差异表达的miRNA是否也参与乳腺癌的转移过程，以及miR-218是否通过某种信号通路途径参与调控过程。

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[收稿2017-04-11 修回2017-05-25]

(编辑 倪 鹏)

EffectsofmiR-218onSNX4proteinonproliferationandinvasionofbreastcancercells

ZHANGJian-Bo,SONGWei,WANGYuan-Yuan,LIUMing-Ge,SUNMiao-Miao.

DepartmentofPathology,CancerHospitalAffiliatedtoZhengzhouUniversity,Zhengzhou450008,China

Objective:To investigate the effect of miR-218 on the proliferation and invasion of breast cancer cells.Methods: The expression of miR-218 in breast cancer tissues and breast cancer cell lines was detected by qPCR.The relationship between the expression of miR-218 and the clinicopathological parameters of breast cancer were analyzed.Double luciferase assay was used to detect the relationship between miR-218 and SNX4.MTT assay and invasion assay were used to detect the proliferation and invasion of breast cancer cells after overexpression of miR-218.MTX assay and invasion assay were used to detect the recovery level of SNX4 on the proliferation and invasion of breast cancer cells.The effect of miR-218 on the tumorigenesis of breast cancer cell lines was examined by tumorigenesis in nude mice.Results: The expression level of miR-218 in breast cancer tissue and MCF-7 cell line was higher.The expression of miR-218 was associated with pathological stage of breast cancer and lymph node metastasis.SNX4 may be the target of miR-218.Overexpression of miR-21 could inhibit the proliferation and invasion of breast cancer cells.Overexpression of SNX4 could reverse the inhibitory effect of miR-218 on breast cancer cells.Overexpression of miR-218 could inhibit the breast cancer cell line in nude mice tumorigenic ability.Conclusion: miR-218 can up-regulate the expression of miR-218 in breast cancer,and miR-218 can regulate the expression of SNX4 in breast cancer cell proliferation and invasion.

Breast cancer;miR-218;SNX4;Invasion

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.09.009

张建波(1971年-)，男，硕士，副主任医师，主要从事肿瘤分子生物学方面的研究，E-mail：drli1978@163.com。

R737.9

A

1000-484X(2017)09-1320-06

①本文为河南省基础与前沿技术研究计划基金(No.102300 410038)。