大瑶山野生茶树的生化特性研究

蒋陈凯，赵文芳，黄亚辉，曾 贞，吴春兰，赖幸菲，袁思思

(华南农业大学园艺学院，广东 广州 510642)

大瑶山野生茶树的生化特性研究

蒋陈凯，赵文芳，黄亚辉*，曾 贞，吴春兰，赖幸菲，袁思思

(华南农业大学园艺学院，广东 广州 510642)

为探究大瑶山山脉野生茶树资源的生化成分特征，本研究测定了来自大瑶山29份茶树单株的19项生化指标。其中用分光光度法检测茶多酚、游离氨基酸、黄酮等含量，用高效液相色谱检测儿茶素、生物碱等组成，用氨基酸分析仪检测氨基酸组成。对主要生化成分进行遗传多样性分析和聚类分析，结果表明大瑶山野生茶具有丰富的遗传多样性和地域独特性，并从中筛选出了一批特异资源，如高氨基酸(>4.00%)资源9份、高咖啡碱(>5.00%)资源23份、高EGCG(>10%)3份。

大瑶山野生茶树；生化特性；聚类分析

茶是当今世界“三大饮料”之一。中国是世界上最早栽培茶树、利用茶叶的国家。中国的广西与云南、贵州毗邻的地区为茶树的次生起源中心之一，且由于广西横跨西南和华南两个茶区，特有的地理生态环境形成了十分丰富的野生茶树种质资源。大瑶山形成于古生代晚期的二叠纪，位于广西中部，山脉为东北-西南走向，是重要的生态屏障，平均海拔1200 m[1, 2]。地质古老独特，气候温和，雨量充足，适合茶树的生长。野生茶树是山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia)茶组(Sect.Thea)植物野生种类的总称[3]。大瑶山得天独厚的环境孕育了大量的野生茶树，其野生茶树资源具有重要的开发价值。生化成分的多样性是DNA遗传多样性的表现形式[4]。茶叶中对机体健康有重要作用的生化成分如茶多酚、氨基酸、咖啡碱等多为茶树的次级代谢产物，且与茶树的抗性和对环境胁迫的适应有关[5]。因此，采用生化成分鉴定是研究、开发、利用野生茶资源的重要参考依据。

目前野生茶树种质资源的研究大多集中于云南、贵州一带[6-7]，较少有对广西野生茶树资源的报道[8-10]。本文对广西大瑶山野生茶树资源的生化成分特征展开系统研究，并据此选出优良单株、特异野生茶资源，如高咖啡碱、高氨基酸、高EGCG等资源，旨在推动野生茶树资源的开发利用，促进茶树育种的科学研究、优质高产茶叶的生产。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验材料 DYS1～DYS13取自六巷上古陈屯，DYS14～DYS23取自罗运白牛屯，DYS24～DYS29取自共和坤林屯。

1.1.2 试验试剂 咖啡因标准品、可可碱标准品、茶叶碱标准品、儿茶素单体(GC、C、EGC、EGCG、EC、GCG、ECG、CG)标准品、游离氨基酸单体标准品(HPLC，Sigma-Aldrich Co. LLC)；甲醇(HPLC，天津市科密欧化学试剂有限公司)；碳酸钠、甲醇、福林酚(Fnlin-Ciocalteu)试剂、没食子酸、草酸、柠檬酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、茚三酮、氯化亚锡、碳酸氢钠、三氟乙酸、三氯化铝、磷酸缓冲液(AR，广州光华化学有限公司)。

1.2 主要仪器设备

AB204-N型电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；DHG-101电热恒温干燥箱(上海跃进医疗器械厂)；DK-8D电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器厂)；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵(河南省巩义市予华仪器有限责任公司)；T6新世纪紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；高效液相色谱仪Agilent 1200(美国Agilent公司)；氨基酸分析仪(日立L-8800型)。

1.3 样品前处理

参考《茶树种质资源描述规范和数据标准》的方法[11]，采摘鲜叶(春季第1轮新梢的一芽二叶)→微波炉杀青→烘干→备用。

1.4 茶叶生化成分测定

水分含量的测定参照GB/T 8304-2013恒重法测定；水浸出物含量的测定参照GB/T 8305-2013全量法测定；茶多酚总量的测定参照GB/T 8313-2008酒石酸亚铁法测定；游离氨基酸总量的测定参照GB/T 8314-2013茚三酮比色法测定[12]。

生物碱和儿茶素单体采用高效液相色谱法测定。色谱条件色谱柱HyPersil ODS2(4.6 mm × 250 mm，5 μm，大连依利特分析仪器有限公司)，柱温35℃，进样量20 μL，流动相A为甲醇，B为0.5‰三氟乙酸水溶液，流速0.8 mL·min-1，检测波长278 nm，洗脱梯度(流动相A的变化)：0～2 min，2% A；2～8 min，A升至8%；8～30 min，A升至10%；30～35 min，A升至20%；35～45 min，A升至25%；45～50 min，A升至30%，并保持5 min；55～60 min，A升至35%。

游离氨基酸单体采用氨基酸分析仪测定，检测依据：JY/T019-1996氨基酸分析方法通则，检测条件：柱温为程序变温，色谱柱为日立855-350型，柱温为134℃，时间为110 min，标准氨基酸浓度100 μmol·L-1，进样量20 μL，温度26℃，相对湿度74%。

1.5 统计分析

各生化成分的最小值、最大值、平均值，Shannon-wiener指数(H′)用Excel2013计算。计算H′前先对数量性状进行质量化处理，以每个性状极差的1/10为间距将各性状分为10个等级，H′=-ΣpilnPi式中：Pi=Ni/N(Pi某性状第i个代码出现的频率，Ni某性状第i个代码出现的个数，N某性状所有代码出现的个数)。

在做聚类分析前，为同等地对待每个变量，消除数据数量级的影响，先对数据做标准化处理，然后计算欧氏距离，计算公式为：

其中，p为变量个数，i、j为样本序号，然后用ward法进行聚类分析，其原理为同类样本之间的离差和应当较小，不同类样本间的离差和应当较大(采用软件R3.1.1处理)。

2 结果与分析

2.1 大瑶山野生茶树资源遗传多样性分析

H′值愈大，群落所含的信息量愈大，当H′>3.0时，表明物种丰富。根据表1可知，大瑶山野生茶树主要生化成分水浸出物、茶多酚、游离氨基酸、黄酮类、生物碱5类基本生化成分的H′均高于3.0，表明大瑶山野生茶具有丰富的遗传多样性。遗传多样性最大的是生物碱，达3.85。儿茶素组成和比例指示着茶树的进化程度，大瑶山野生茶儿茶素总量、酯型儿茶素、非酯型儿茶素的H′分别为3.08、3.11、3.01，说明大瑶山野生茶树进化类型跨度大。一般情况下，咖啡碱是茶叶中含量最高的生物碱，大瑶山野生茶树咖啡碱的H′为3.86，其咖啡碱亦具有丰富的遗传多样性。

分别从六巷上古陈屯、罗运白牛屯、共和坤林屯随机选取6个单株根据生化成分做聚类分析，可将大瑶山野生茶为3类。第一类为DYS14、16、17、18、19、20，均来自罗运白牛屯；第二类为DYS24、25、26、27、28、29，均来自共和坤林屯；第三类为1、2、5、9、10、12，均来自六巷上古陈屯。来自同一地区的单株聚为一类，说明大瑶山野生茶具有显著的地域独特性，每个地域之间的差异明显(图1)。

表1 主要生化成分特征值

图1 大瑶山野生茶树聚类分析图Fig.1 Cluster analysis on wild tea plants from Mt. Dayao

2.2 大瑶山野生茶树资源生化特异性评价

在29份单株野生茶中，水浸出物含量在50%以上的有5个单株，其中白牛3个、六巷2个。游离氨基酸总量在4%以上有9个，其中，六巷5个、共和4个。咖啡碱具有降血糖、抗抑郁、提高神经活动的兴奋性等功效[17-18]，其含量超过5%的种质资源称为高咖啡碱资源[19]，大瑶山野生茶树的咖啡碱平均值为5.77%，有望成为选育高咖啡碱茶树的种质资源。高咖啡碱资源有23个，其中六巷13个、共和6个、白牛4个。茶多酚与游离氨基酸的比值称为酚氨比，是指示茶叶试制性、制茶品质的重要指标。茶树鲜叶的化学成分与制茶品质息息相关，鲜叶的化学组成可以指导生产实践，为确定茶叶的生产季节、加工工艺奠定基础。酚氨比的范围在5.15～14.24之间，其中酚氨比平均值最高的为DYS 18，最低为DYS29。适制绿茶的有12个，六巷7个，白牛1个，共和4个。红绿茶兼制的有14个，六巷4个，白牛9个，共和1个。说明大瑶山野生茶中既有适制绿茶的品种，也有适制红茶的品种。

表2 基于生化成分的特异资源

3 结论与讨论

大瑶山野生茶树资源在生化成分不仅含量丰富且变化幅度非常大，与大瑶山的地理环境密切相关。大瑶山主体山脉，山高谷深，云雾缭绕，土壤有机质丰富，这样特有的地理生态环境有利于形成十分丰富的茶树种质资源。原始型的茶树儿茶素组成中以非酯型儿茶素为主，进化型的茶树儿茶素则以酯型儿茶素为主[24]。一方面儿茶素类型指示着茶树的进化状态；另一方面，儿茶素类型与茶叶滋味、茶叶保健功效密切相关。酯型儿茶素较非酯型儿茶素苦涩味更重，抗氧化效果更加突出[25]。大瑶山野生茶树的29个单株酯型儿茶素与非酯型儿茶素的含量比例变异较大，且非酯型儿茶素遗传多样性指数更大。综合茶树资源的进化轨迹[26]和此研究的生化成分聚类结果以及地理环境和形态调查可推测，大瑶山野生茶树资源处在进化与原始之间，存在丰富的遗传多样性和地域的独特性。

由于EGCG能够抗氧化，提高碱性磷酸酶活性[20]，高 EGCG 茶在国内外市场有着广阔的发展前景[21, 22]，DYS11、DYS12、DYS3为高EGCG资源。DYS11为高酯型儿茶素单株，高酯型儿茶素的单株可作为品质遗传改良或直接应用于提取酯型儿茶素的重要材料。氨基酸是构成茶叶品质重要化学成分，与茶叶嫩度和香气的形成有密切关系，对茶汤的滋味、香气和色泽的形成具有重要作用。而茶叶中的主要氨基酸茶氨酸具有安神、降压、增强免疫等多种生理功能，高茶氨酸茶树具有重要价值[23]。大瑶山野生茶游离氨基酸总量较丰富，平均值为3.60%，其原因可能是大瑶山具有相对低温、高湿的气候特征，有助于氨基酸等含氮物质的生物合成。这些特异的野生茶树资源即可成为培育特用商业品种的育种材料，也可作为杂交亲本材料。

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Biochemicals in Leaves of Wild Tea Plants in Mt. Dayao

JIANG Chen-kai, ZHAO Wen-fang, HUANG Ya-hui*, ZENG Zhen, WU Chun-lan, LAI Xin-fei, YUAN Si-si
(CollegeofHorticulture,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou,Guangdong510642,China)

Nineteen characteristic biochemicals in 29 leaf samples from varied wild tea plants found in Mt. Dayao were studied. Contents of polyphenols, free amino acids and flavonoids were determined using ultraviolet and visible spectrophotometry; constituents of catechins and alkaloids, using high performance liquid chromatography (HPLC); and, components of amino acids, using an amino acid analyzer. Subsequently, genetic diversity and cluster analysis were performed on the biochemical components. The result showed that the wild tea plants were genetically significantly diversified with unique regional characteristics. For instance, the leaves of 9 tea germplasms showed high amino acid contents (>4.00%), 23 had high caffeine contents (>5.00%), and 3 had high epigallocatechin gallate (EGCG) contents (>10%).

wild tea plants; biochemical characteristics; cluster analysis

2017-11-24初稿；2017-01-21修改稿

广东省科技计划项目(2013B020201003、2015B020202007、2016A020208012、2016A020210070)；广东省产业体系(2016LM1117)；桂科(AB16380063)。

蒋陈凯(1990-)，女，硕士研究生。研究方向：茶叶深加工及类茶植物资源。E-mail:greenbreezekai@126.com

*通信作者：黄亚辉(1969-)，博士，研究员。研究方向：茶叶深加工、茶树资源调查与品种选育。 E-mail:13501513191@163.com

S571.1

A

2096-0220(2016)02-0008-05